影像科学与光化学  2012, Vol. 30 Issue (2): 102-109   PDF (974 KB)    
引用本文
张兵, 史京京, 王颖, 郭燕川, 陈丽娟. 酸预处理对酶法骨明胶功能性质和分子质量分布的影响[J]. 影像科学与光化学, 2012, 30(2): 102-109.  
ZHANG Bing, SHI Jing-jing, WANG Ying, GUO Yan-chuan, CHEN Li-juan. Effect of Acid Pretreatment on IEP and Protein Patterns of Gelatin from the Bovine Bones by Protease-Conditioned Process[J]. Imaging Science and Photochemistry, 2012, 30(2): 102-109.  
酸预处理对酶法骨明胶功能性质和分子质量分布的影响
张兵 , 史京京, 王颖, 郭燕川, 陈丽娟    
中国科学院 理化技术研究所, 北京 100190
收稿日期：2011-10-09，录用日期：2011-12-30
基金项目：中国科学院知识创新工程青年人才领域前沿项目(TYF0902).
通讯作者：张 兵(1976-),女,副研究员, 主要从事明胶和水解胶原蛋白的制备与应用研究,E-mail:zhangbing@mail.ipc.ac.cn.
摘要：本文以牛骨粉为原料,采用酶解法制备明胶,考察了骨粉预处理试剂——盐酸的浓度对明胶产品的冻力、粘度、分子量分布和等电点的影响.研究表明,随着骨粉预处理用的盐酸浓度的增大,明胶产率降低.骨粉经过盐酸预处理后,明胶产品的冻力大于300 bloom g,高于原料未经盐酸处理得到的明胶产品.与传统的碱法工艺明胶相比,酶法明胶具有高冻力、高等电点和相对较低的粘度等特点.采用聚丙烯酰胺凝胶电泳表征明胶的分子质量分布,酶法明胶不但具有传统碱法明胶具有的96 KDa、97 KDa、193 KDa和289 KDa组分,而且具有165 KDa和120 KDa组分.酶法明胶的等电点在碱性范围内,随着预处理用盐酸浓度的增大,明胶产品的等电点升高.骨料的预处理工艺对明胶的产率、冻力、粘度、等电点和分子质量分布有重要的影响,在明胶制备过程中,通过调控骨料预处理酸浓度可以调控明胶的技术指标.
关键词： 明胶     酶解法     酸预处理     等电点     分子量分布    
Effect of Acid Pretreatment on IEP and Protein Patterns of Gelatin from the Bovine Bones by Protease-Conditioned Process
ZHANG Bing , SHI Jing-jing, WANG Ying, GUO Yan-chuan, CHEN Li-juan    
Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, P.R. China
Abstract: Gelatins were prepared from the bone pretreated using hydrochloride with various concentrations by protease-conditioned method in this article. The yields of protease-conditioned gelatin were decreased as the concentration of HCl was increased from 0 to 4.5% (mass fraction). The bloom values of protease-condition gelatin were all higher than 300 when the bovine bone were pretreated with HCl. Compared with commercial type B gelatin, protease-conditioned gelatin exhibited higher bloom strength, lower viscosity and higher IEP value. Compared with protein patterns of type B gelatin, different protein patterns of protease-conditioned gelatin were noticeable with the immersing of the new bands at the Mw of 165 KDa and 120 KDa. The IEPs of protease-conditioned gelatin were all in alkaline range which was related to the content of arginine. The results showed that the pretreatment process of bone was very important for protease-conditioned gelatin because the yield, viscosity and IEP were determined by the pretreatment condition.
Key words: gelatin     protease-conditioned     acid pretreatment     IEP     protein patterns    

明胶是胶原经过热解变性后的产物，广泛的应用于食品、医药和照相领域[1, 2, 3, 4, 5].明胶的功能性质包括冻力、粘度、等电点等，它们受多种因素的影响，比如制备方法，酸、碱处理的反应条件，提取温度和时间等[6].以动物骨为原料制备明胶，国际上和国内的大型明胶生产厂都采用碱法工艺.碱法工艺的生产周期通常为60—100天，经过骨料分选、浸酸、浸灰、中和、提胶等步骤，仅浸灰步骤就需要50—90天.在浸灰过程中，石灰对胶原发生温和的降解，破坏胶原三股螺旋的有序排列结构.变性胶原在热抽提的过程中，转化为以单分子链为主要成分的明胶.

酶是一种生物催化剂，与化学试剂相比，它能够降低反应的活化能，提高反应速度，减少酸碱等污染物的排放，而且对胶原分子内酰胺键的剪切具有定向性.与传统酸碱工艺相比，酶解工艺使胶原转变为明胶的过程更加快速、高效和清洁[7]，①.从上世纪30年代起，国外就有关于酶解胶原制备明胶的报道，酶的种类包括黑曲霉[8]、胃蛋白酶[9,10]、中性蛋白酶[11]、胰蛋白酶[12]等.然而，在之前的文章中，酶法明胶的冻力很难达到200 bloom g.陈丽娟等[10]采用酶解过程取代浸酸、浸灰和中和3个最耗时的过程制备明胶，冻力为200 bloom g，但粘度最高达到3.5 mPa·s.对于酶解工艺制备明胶，除了酶的因素以外，骨料的预处理、酶解过程中的实验参数也对制备高质量的明胶具有非常重要的影响.

明胶冻力和粘度主要取决于它的分子量分布[13]，冻力主要取决于α组分含量，与高分子组分的含量无关；而粘度取决于β组分及高于β组分分子量的组分含量[14,15].因此，可以通过分子质量分布来解释明胶的冻力和粘度性质.

本文采用酶解法制备明胶，考察了骨粉的酸预处理对酶法明胶功能性质和分子量分布的影响，分析了明胶分子量分布与明胶粘度和冻力的关系，并与商业化的碱法骨明胶的性质做了对比. 1 实验部分 1.1 原材料和制备方法

牛骨粉由青海明胶有限公司提供.原材料首先用不同浓度的盐酸进行搅拌处理，离心后固体用水洗至pH 4.5以上，以去除骨料中的杂质和未充分反应的盐酸.预处理后的骨料分散在水中，骨与水质量比为1∶3，混合物用蛋白酶降解，酶解后用石灰调混合浆料的pH至9.0，加热混合浆料至70 ℃，保持1 h后过滤，清液为明胶和少许无机盐杂质的混合溶液.用棉饼过滤去除胶液中的固体悬浮颗粒，过棉后的胶液再通过离子交换树脂，去除可溶性无机盐.过树脂后的胶液用冷冻干燥机干燥.称量干燥明胶的重量，并计算产率.预处理盐酸浓度分别为0、1.8%、3.5%和4.5%(均为质量分数)，得到的干明胶被简写为G1、G2、G3、G4.商业化碱法明胶由青海明胶有限公司提供，简称为B. 1.2 分析测试 1.2.1 骨料粒度测试

采用Malvern公司Mastersize 2000激光粒度仪测试骨粉的粒度.将骨粉分散在水中，超声处理2 min，随后进行粒度测试. 1.2.2 冻力测试

精确称量一定量的明胶，配制120 g浓度为6.67%的明胶溶液.药用明胶行业标准QB 2354—2005中明胶溶液的配制不考虑试样本身的水分，但自制明胶的水分与商品明胶(12%水分)相差较大，因此本文中明胶的配制方法如下：考虑明胶的含水量，按含水12%的明胶为基准，配制120 g 6.67%(质量分数)的明胶溶液(实际含绝干胶7.04 g)，所有明胶均按12%水分的明胶进行折算，具体公式如下：

称样量(g)= 8×(100-12)/(100-实测水分)

将精确称量的明胶(精确到0.01 g)在常温去离子水中溶胀2 h，然后在水浴中加热至60 ℃，最终溶成均匀的液体.冷却至30 ℃，放入10±0.1 ℃低温水浴中放置17 h，采用天津国铭JS-2冻力仪测试凝胶的冻力，深度4 mm，速度0.5 mm/s. 1.2.3 粘度测试

待测明胶溶液的浓度为6.67%(质量分数)，溶液的配制方法与冻力测试相同.采用天津国铭ND-1勃氏粘度测试仪测定明胶的粘度. 1.2.4 水分和灰分测试

按照药用明胶行业标准QB 2354—2005执行. 1.2.5 等电点测试

配制0.5%的明胶溶液100 mL，配制方法见1.2.1.待胶液冷却至32 ℃左右时，称取阴离子和阳离子树脂各2.5 g加入到胶液中.将三角烧瓶置于磁力搅拌器上于水浴30±2 ℃条件下搅拌1 h.然后，将上清胶液倒入一小烧杯中，测定胶液的pH.此pH值即为明胶的等电点，要求两次测量结果误差小于0.1.

实验前阴离子和阳离子树脂的处理方法：

阴离子处理方法：将新买的阴离子树脂用4%氢氧化钠溶液浸泡120 min，然后倒去碱水，用去离子水洗至pH=8—9，浸在纯水中备用.

阳离子处理方法：将新买的阳离子树脂用7%盐酸溶液浸泡60 min—90 min，然后倒去酸水，用去离子水洗至pH=4—5，浸在纯水中备用. 1.2.6 电泳分析

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分离明胶中的蛋白质组分.样品缓冲液的组成为0.05 mol/L NaH2PO4-NaOH，2%(质量浓度)SDS，1.5%(质量浓度)丙三醇和0.02%(质量浓度)溴酚蓝(BPB).凝胶板由丙烯酰胺和N，N′-甲基-双丙烯酰胺聚合而成，用梯度混合器使两者的浓度和交联度从板的底部到上部连续降低.待测样品的加样量为40 μg，电压100 V.电泳结束后，凝胶板用考马斯亮蓝R-250染色，10%甲醇和7.5%冰醋酸混合溶液脱色.采用凝胶分析系统对各样品的泳道进行分子量分布分析. 1.2.7 氨基酸组成测试

明胶的氨基酸组成测试按照GB/T 5009/124—2003执行，由北京谱尼测试中心测试. 2 结果与讨论

传统碱法工艺通常需要5次加热才能将骨中的明胶全部提取出来，通常一道明胶的提取温度最低，一般为55 ℃,二道胶提取温度为60 ℃,随提取次数的增多,提取温度升高，明胶的功能性质越差,冻力和粘度均有所降低.为了比较酸预处理对产物中优质胶的影响，本文中仅比较第一次提取的明胶即一道胶的产率，以下的功能性质指标均为第一道明胶的测试结果. 2.1 产率

不同预处理工艺得到的明胶产率见表1.G1是骨料未经盐酸预处理制备的明胶，产率达到14.75%.传统工艺平均7吨骨料产出1吨明胶，五次提取的明胶的总产率大约为14.3%，其中第一道胶的产率仅为总产率的25%.由G1的产率可以看出，通过酶解法制备明胶是非常高效的，酶法工艺第一道胶的出胶率甚至略高于传统工艺五道胶的总产率.传统工艺的浸灰过程需要50天以上，而从酶解过程开始到明胶溶液的产出仅需要3 h—4 h.随着预处理盐酸浓度的增加，产率下降.当预处理用盐酸的浓度增大到4.5%时，产率降低至8.33%，这可能是由于部分胶原被盐酸溶解而流失.对于传统碱法工艺，浸酸过程中骨料的粒径为5 mm—20 mm，盐酸的浓度不高于4%(质量分数).本文中骨料的粒径为0.3 μm—700 μm，体积平均粒径为98.8 μm(见图1)，骨粉的比表面积较骨块要大得多，盐酸可以充分的与骨中的无机物、脂肪、非胶原蛋白及胶原发生反应，因此对明胶的产率产生了重要的影响.从产率的角度分析，预处理用盐酸的浓度增大会降低明胶的产率，在优化明胶制备工艺过程中，需要充分考虑这一点.

图1 骨粉的粒度分布图 Diameter distribution of bone powder
2.2 酶法明胶的功能性质

不同预处理条件下，明胶的冻力、粘度和灰分的数值见表1.与G1相比，经盐酸预处理骨料制备的明胶具有更高的冻力.决定明胶质量最关键的指标是冻力，低档明胶的冻力小于150 bloom g，中档明胶的冻力为150 bloom g—220 bloom g，高档明胶的冻力大于220 bloom g[16]，在碱法工艺中，冻力高于300 bloom g的明胶较少.冻力的差别主要归因于产物的组成，尤其是氨基酸的组成和蛋白质链的长度.本文采用青海明胶公司提供的碱法工艺第一道胶作为参比，其冻力为271 bloom g，酶法明胶的冻力均高于该明胶，骨料经盐酸预处理后制备的明胶冻力更高，均达到300 bloom g以上.从分子结构的角度，通常认为α组分含量高有利于增大明胶的冻力，这将在下面分子量分布一节进一步阐述.

表1 明胶的产率与技术指标 Yield and functional properties of gelatin (G1，G2，G3，G4 and B)

明胶的粘度是仅次于明胶冻力的重要指标，明胶中高分子组分含量越多，则粘度越大，从表1可以看出，酶法明胶G1、G2、G3和G4的粘度分别为4.67、4.11、4.11和3.72 mPa· s，随着盐酸浓度的增大，明胶的粘度呈降低的趋势.这可能是由于骨料经盐酸预处理后，胶原三螺旋结构更容易解旋，进而更多的形成单链(α组分及低分子组分)的明胶，导致双链(β组分)和三链(γ组分)的大分子组分减少.

透过率与样品的杂质含量和等电点有关.通常以450 nm的透过率代表溶液颜色的深浅，透过率越高，溶液越接近无色；620 nm的透过率代表溶液的透明度，该波长下透过率越高，溶液越透明.最高档的明胶在上述两个波长下的透过率均能够达到90%以上.按照QB2354—2005骨制药用明胶的合格标准，450 nm和620 nm的透过率应分别大于70%和85%，从表1可以看出，未经盐酸预处理骨料制备的明胶，450 nm的透过率仅为53.1%，不能够达到药用明胶的检测标准.经过盐酸预处理后的明胶，透过率都达到了药用明胶的标准，因此盐酸预处理对于明胶的透过率起到了非常关键的作用.G1的灰分仅为0.26%，是所有酶法明胶中最低的，却具有最低的透过率，这可能与G1的等电点有关.明胶在等电点pH时，分子收缩，溶液具有最低的粘度和透过率.

2.3 等电点与氨基酸组成分析

等电点影响明胶溶液的发泡能力和稳定性，对明胶的应用范围有一定的限制.在混胶过程中，不同等电点的明胶混合使用会导致溶液的透明度下降，粘度降低.通常，酸法明胶(A型)的等电点在6—9.5之间，碱法明胶的等电点在4.7—5.6之间.通过表1可以看出，酶法明胶(G1—G4)的等电点分别为7.4、7.7、7.9和8.1，均处在中性到弱碱性范围内.明胶的等电点与氨基酸组成密切相关.

根据Eastoe和Leach[17]，当胶原长时间处于碱性环境中时，天冬酰胺和谷氨酰胺将发生脱氨基化，生成谷氨酸和天冬氨酸，导致等电点降低.酶解工艺中，骨料不与碱发生反应，其等电点与酸法明胶在相同的范围内.我们测试了G1—G4以及碱法明胶(B)的氨基酸组成，结果见表2，碱法明胶的精氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的含量明显低于酶法明胶，其余氨基酸组成与酶法明胶相近.精氨酸是碱性氨基酸，pH为10.76，具有高精氨酸含量的明胶等电点增高，这可能是酶法明胶具有高等电点的重要原因.

表2 酶法明胶(G1、G2、G3、G4)和碱法明胶(B)的氨基酸组成(单位：g/100g) Amino acid composition of gelatin (G1,G2,G3,G4 and B)
2.4 分子量分布分析

明胶的分子量分布与胶原的性质以及工艺过程有关，分子量分布对明胶的凝胶性质 和流变学性质有重要的影响.商业化的碱法明胶和酶法明胶的凝胶电泳图见图2.酶法明胶具有典型的碱法明胶的泳带，分别对应的是α1(97 KDa)、α2(96 KDa)、β(193 KDa)和γ(289 KDa)链组分.根据电泳带的迁移距离和已知分子量，我们采用凝胶分析系统计算出酶法明胶的其他电泳带的分子量，分子量分别为64 KDa、120 KDa和165 KDa.当明胶用盐酸处理后，64 KDa分子量组分的含量增加.这可能是由于盐酸对骨料预处理导致胶原中的某些特定的酰胺键在酶解或热抽提过程中容易发生断裂.通常低分子量组分含量增加将降低产品的粘度.因此G2、G3和G4与未经盐酸处理的G1相比，具有相对较低的粘度.120 KDa和165 KDa是酶法明胶的特征分子量，传统的酸法和碱法明胶都不存 在这两个组分.β组分(193 KDa)包含3种结构，分别为α11、α12和α22.这两种介于 97 KDa和193 KDa之间的组分可能是β组分中的某一种结构或两种结构的组分进一步降解的结果，其中一条α链被酶剪切，形成了分子量介于完整单链(分子质量97 KDa)和完整双链(分子质量193 KDa)之间的组分，以及低于α1和α2分子量的组分.从明胶的冻力比较来看，尽管酶法明胶具有大量的64 KDa的组分，但其冻力远高于碱法明胶，推测这部分组分对于明胶的冻力具有一定的贡献.

图2 明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图 SDS-PAGE image of gelatin
3 结论

本文以牛骨粉为原料，用盐酸对骨料进行预处理后，采用酶解法制备明胶，该明胶不但具有高冻力，而且粘度和透明度均达到了国家药用明胶的检测标准.酶法明胶的等电点与酸法明胶比较接近，在中性到碱性范围内.酶法明胶与碱法明胶的凝胶电泳实验表明，与碱法明胶相比，酶法明胶包含更多的组分，其中165 KDa、120 KDa和64 KDa都是碱法明胶中没有的.酶法明胶中包含了较多的低于96 KDa的低分子量组分，尤其是64 KDa组分.尽管如此，酶解明胶仍具有高的冻力，说明64 KDa以上的组分可能对明胶的冻力都具有一定的贡献.与未经预处理的骨料相比，经过盐酸预处理的骨料提取出的明胶具有更高的透过率和冻力，随着预处理浓度的增加，透过率增大，但粘度降低.在优化明胶提取工艺过程中，可以根据所需明胶的指标要求，调变骨料的预处理工艺.

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