过渡金属及重金属元素在自然界中含量丰富，其中一些金属元素在生命过程中起着非常重要的作用[1]。在大脑中，铁元素是含量最为丰富的过渡金属元素，脑组织可充分利用它并将它转化为某些酶的重要组成部分，共同参与氧气的运输与代谢；而且铁元素在许多金属蛋白酶中也是不可或缺的组成部分；同时，在生命体的有氧代谢与电子转移等过程中，铁元素扮演着酶的催化剂等重要角色，因而铁离子的转运与传递、储存与利用，以及平衡与代谢等过程都与有机体的生理功能密切相关，铁离子的缺乏或过量都会导致严重的机体功能紊乱[3,4,5,6]，但是由于Fe(Ⅲ)的顺磁性，通常会使荧光猝灭[7,8,9,10]，因此荧光增强型的Fe3+探针很少见报道。
随着生命科学、有机化学、分析化学和材料化学等多学科多领域的研究不断交叉深入，以及荧光检测技术的不断提高，化学传感越来越依赖于新颖的传感材料来实现其价值。在小分子荧光化合物出现后，通常利用固载技术将小分子荧光化合物引入到固相载体中，制造出荧光传感材料[11]。其中应用较广泛和成熟的一类材料是硅胶纳米颗粒材料，它是一类良好的荧光传感材载体，尺寸处于料纳米级，对细胞没有明显的毒性，其骨架对热、pH以及机械应力稳定，同时其比表面积大、负载量高等优点使其可利用范围广。通过将小分子荧光探针进行硅烷化修饰后，将其共价键合到硅胶颗粒上，可以制得能够检测各种目标分子的荧光传感材料。
在小分子荧光团中，萘酰亚胺类荧光团因具有高荧光量子产率、光稳定性和化学稳定性以及较大的Stokes位移等特点而得到广泛应用[12,13,14,15]。本文选择萘酰亚胺作为荧光团，通过哌嗪与N-2-氯乙酰氨基喹啉反应得到目标探针 NPAP ，其作用机理是：当体系中没有Fe3+离子存在时，哌嗪的氮原子上的孤对电子对萘酰亚胺荧光团产生PET(photo induced electron transfer ，光诱导电子转移)过程，因而荧光比较弱；当体系中有Fe3+存在时，探针与Fe3+结合后抑制其PET过程，荧光团的荧光发射出来。同时，本文将Fe3+离子小分子荧光探针 NPAP 通过硅烷化修饰后得到了化合物 B4 ，然后共价键合到硅胶颗粒表面，得到了Fe3+离子荧光传感器 FS 。
1 实验部分 1.1 仪器和试剂Avance 400 MHz (Bruker)核磁共振仪(TMS为内标)，MicroMass GCT CA055质谱仪(ESI源)，Varian Cary Bio 100紫外光谱仪，Varian Cary Eclipse Bio荧光光谱仪，SZ-98自动双重纯水蒸馏器(上海本波仪器)，Sartorius PB-10精密数显酸度计。
实验制备过程中所用试剂均为市售分析纯试剂；二甘醇胺、无水哌嗪购于阿拉丁试剂公司；N,N-二异丙基乙基胺(N,N-Diisopropylethylamine，DIPEA)购于邦成化工公司；柱色谱硅胶为青岛海洋化工厂产品(300～400目)。
1.2 Fe3+离子小分子荧光探针NPAP和荧光传感器FS的合成探针NPAP的合成路线如图1所示，由原料8-氨基喹啉与2-氯乙酰氯反应得到化合物 B1 ，然后由原料4-溴-1,8萘酐 B0 与二甘醇胺反应得到 N-取代萘酰亚胺 B2 ，再与无水哌嗪反应得到化合物 B3 ，最后与化合物 B1 反应得到探针 NPAP 。
 | 图1 荧光探针 NPAP 的合成路线 Synthesis of the fluorescent sensor NPAP |
荧光传感器 FS 的合成路线如图2所示，将化合物 NPAP 进行硅烷化修饰得到化合物 B4 ，然后与事先预处理好的二氧化硅硅胶纳米颗粒共价键合，得到荧光传感器 FS 。
 | 图2 荧光传感器 FS 的合成路线 Synthesis of the fluorescent sensor FS |
将576.0 mg(4.0 mmol)8-氨基喹啉和0.5 mL吡啶溶于20 mL重蒸过的氯仿中，再将542.0 mg(4.8 mmol)氯乙酰氯在冰浴下缓慢滴加到上 述反应液中，滴加完毕撤去冰浴，室温反应2h，TLC跟踪反应结束后，停止反应，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯，5∶1，V/V)得白色针状晶体 B1 ，760.0 mg，收率为86.6%。
1.2.2 化合物 B2 的合成将500.0 mg(1.8 mmol)4-溴-1,8-萘酐( B0 )、190.0 mg 2-(2-氨基乙氧基)乙醇溶于10 mL无水乙醇中，加热回流1 h，冷却至室温，放置过夜，析出晶体，抽滤取滤饼，红外烘干得N-(2-(2-羟乙氧基)乙基)- 4-溴-1,8-萘酰亚胺黄色晶体( B2 )，515.0 mg，收率为78.6%，熔点：132.0～133.6 ℃。
1.2.3 化合物 B3 的合成将500.0 mg (1.3 mmol)N-(2-(2-羟乙氧基)乙基)- 4-溴-1,8-萘酰亚胺( B2 )和454.5 mg(5.3 mmol)无水哌嗪溶于15.0 mL乙二醇单甲醚中，加热回流，氩气保护下反应10 h，停止反应，旋干溶剂，硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇，15∶1，V/V)，得到化合物 B3 ，450.0 mg，收率为92.3%，熔点：198.0～200.0 ℃。1HNMR (400 MHz,CDCl3): 2.0 (br,1H) ,3.20 (d,J=4.4 Hz,4H),3.24 (d,J=4.8 Hz,4H,),3.66 (br,2H),3.67 (br,2H),3.84 (t,J=5.6 Hz,2H),4.43 (t,J=5.6 Hz,2H),7.20 (d,J=8.0 Hz,1H),7.69 (t,J=7.8 Hz,1H),8.42 (d,J=8.4 Hz,1H),8.53 (d,J=6.8 Hz,1H),8.58 (d,J=6.8 Hz,1H)。
1.2.4 化合物NPAP的合成
将200.0mg(0.9mmol)N-2-氯乙酰氨基喹啉(B1)，365.6mg(1.0mmol)化合物B3，60.0mg碘化钾，2mLN,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于60.0mL乙腈中，在氩气保护下加热回流反应10h，停止反应后，旋干溶剂，硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇，70∶1，V/V)，得黄色晶体NPAP，260.0 mg，收率为54.2%。1HNMR(400MHz,CDCl3):3.03(br,4H),3.45(br,6H),3.67(d,J=12.4Hz,4H),3.84(br,2H),4.41(br,2H),7.25 (d,J=8.0Hz,1H),7.43(t,J=3.6Hz,1H),7.51(d,J=7.2Hz,2H),
7.66(t,J=7.2Hz,1H),8.38(d,J=8.0Hz,1H),8.52(t,J=7.2Hz,2H),8.76(d,J=6.0Hz,1H),8.83(s,1H),11.44(s,1H)。13CNMR
(100MHz,CDCl3):39.3,53.3,53.4,61.8,62.4,68.5,72.3,115.0,116.6,121.6,121.9,123.0,125.8,126.1,127.3,128.0,
129.9,130.4,131.3,132.7,134.1,136.2,138.9,148.6,155.9,164.2,164.6,168.6。HRMS(ESI)calcd.For C31H31N5O5 [M+H+]554.2325，found 554.2404。
将50.0 mg(90.0 μmol) NPAP 和178.0 mg(72.0 μmol)化合物 B 溶于10.0 mL重蒸过的甲苯中，然后滴加4滴二异丙基乙基胺，在氩气保护下加热、回流反应72 h。停止反应后，旋干溶剂，TLC大板分离(二氯甲烷/甲醇，40∶1，V/V)，得黄色固体50.0 mg，收率为69.4%。1HNMR (400 MHz,CDCl3): 0.63 (t,J=9.2 Hz,2H),1.27 (s,9H),1.62 (t,J=8.4 Hz,2H),3.07 (br,4H),3.15 (t,J=6.4 Hz,2H),3.49 (br,4H),3.52 (br,4H),3.76 (br,4H),3.80~3.87 (m,8H),4.20 (br,2H),4.46 (t,J=6.0 Hz,2H),7.33 (d,J=8.0 Hz,1H),7.48 (q,J=8.0 Hz,1H),7.56 (d,J=8.0 Hz,1H),7.60 (d,J=8.0 Hz,1H),7.74 (t,J=8.0Hz,1H),8.19 (d,J=7.6 Hz,1H),8.47 (d,J=8.4 Hz,1H),8.59 (d,J=8.4 Hz,1H),8.61 (d,J=7.6 Hz,1H),8.81 (dd,J1 =6.8 Hz,J2 =1.6 Hz,1H),8.88 (d,J=2.8 Hz,1H),11.50 (s,1H)。HRMS (ESI) calcd. For C41H52N6O9 [M+Na+] 823.3463，found 823.3465。
1.2.6 荧光传感器 FS 的合成将10.0 mg化合物 B4 和1.5 g经过活化的硅胶于15.0 mL无水甲苯中混合，氩气保护下加热回流反应72 h，停止反应后，过滤，取滤饼，滤饼用无水乙醇洗涤至没有颜色，所得到的固体在甲醇中回流24 h，然后过滤，所得固体在120 ℃烘箱干燥24 h，得到荧光传感器 FS 。
2 结果与讨论 2.1 探针NPAP对Fe3+离子的滴定曲线我们在0.01 mol/L Tris-HCl (乙腈/水，80∶20，V/V)，pH=6.46，探针 NPAP (0.5 μmol/L)的测试条件下，检测其探针随着Fe3+的加入的荧光 发射光谱。如图3所示，随着Fe3+不断加入，探针NPAP的荧光强度不断增强，最后当Fe3+离子加到320当量时，荧光强度不再增强，其荧光增强10倍，且伴随着波长20 nm的蓝移(从540 nm到520 nm)。
 | 图3 探针 NPAP (0.5 μmol/L)在不同Fe3+的荧光光谱图插图是探针 NPAP 在520 nm处的荧光强度与Fe3+浓度的关系 Fluorescence spectra of NPAP (0.5 μmol/L) in the presence of increasing concentrations of Fe3+ ,inset: integrate fluorescence intensity as a function of Fe3+ ion concentrations |
进一步研究了pH值对体系的影响。pH滴定实验是在0.01 mol/L Tris-HCl(乙腈/水，80∶20，V/V)中测定。图4表明，探针 NPAP 在波长为520 nm处的荧光强度随着pH值的增加而降低，且伴随着20 nm的红移(从520 nm到540 nm)。这是因为在酸性条件下，哌嗪上氮原子被质子化，抑制其PET过程，导致荧光增强；另外，哌嗪上氮原子弱的ICT(Intramolecular Charge transfer)过程导致其波长稍微红移。然而，在pH 6.0～12.0的范围内，探针 NPAP 荧光强度几乎保持不变，如图5所示，即此探针能在宽pH范围内稳定，不受pH影响。
 | 图4 探针 NPAP (0.5 μmol/L)在不同pH下发射光谱的变化 Fluorescence spectra of NPAP (0.5 μmol/L) at different pH values |
 | 图5 探针 NPAP (0.5 μmol/L)的荧光强度对pH的变化曲线 Fluorescence response of NPAP (0.5 μmol/L) at different pH values |
前面我们已经探讨了探针 NPAP 在不同pH下光谱性能和对Fe3+的识别性能，但是考察探针的另一个指标是选择性。如图6和图7所示，探针对Fe3+有较高的选择性，其中Fe2+、Zn2+、Hg2+、Pb2+、Co2+、Cd2+等离子都没有响应，其中Cu2+离子是荧光猝灭的，Cr3+离子是荧光增强的，且荧光增强1倍。实验结果表明探针 NPAP 对Fe3+离子是一个荧光增强型(turn-on)探针。
 | 图6 探针 NPAP 对不同离子的荧光光谱图 Fluorescence spectra of NPAP (0.5 μmol/L) to different metal ions (1.6 μmol/L) |
 | 图7 探针 NPAP 对不同离子的荧光响应曲线 Fluorescence response of NPAP (0.5 μmol/L) to different metal ions (1.6 μmol/L) |
探针 NPAP 的竞争性如图8所示，可以看出，除Cr3+离子有一定的干扰外，探针 NPAP 不受其他离子的干扰。选择性和竞争性实验结果表明，NPAP 是一个选择性识别Fe3+的turn-on探针。
2.3 荧光传感器FS对Fe3+的滴定曲线FS 对Fe3+的滴定在0.01 mol/L Tris-HCl (乙腈/水，80∶20，V/V)，pH=6.46中测试，如图9所示，随着Fe3+离子浓度的增加，FS的荧光逐渐增强，且伴随着波长稍微的蓝移(约5 nm)，且在20～140 μmol/L Fe3+离子含量范围内，FS 的荧光强度与Fe3+离子浓度呈良好的线性关系(R2 = 0.9023)。
 | 图8 探针 NPAP (0.5 μmol/L)的竞争性实验：在存在其他离子3.2 当量的溶液中，加入3.2 当量的Fe3+ 后的荧光响应 The florescence intensity of NPAP (0.5 μmol/L) with 3.2 equiv of Fe3+ and other metal ions |
 | 图9 探针 NPAP (0.5 μmol/L)的竞争性实验：在存在其他离子3.2 当量的溶液中，加入3.2 当量的Fe3+ 后的荧光响应 Fluorescence spectra of FS in the presence of increasing concentrations of Fe3+ |
 | 图10 FS 荧光强度与Fe3+浓度的曲线 The integrate fluorescence intensity of FS as a function of Fe3+ ion concentration |
以萘酰亚胺作为荧光团，通过哌嗪与N-2-氯乙酰氨基喹啉(受体)反应得到基于PET原理的荧光增强型(turn-on)Fe3+探针，此探针能在pH6.0～12.0范围内保持荧光强度不变，而且能选择性识别溶液中的Fe3+，具有良好的选择性和灵敏性。同时将NPAP硅烷化修饰后，共价键联到硅胶颗粒上得到荧光增强型Fe3+传感材料 FS ，且在20～140 μmol/L Fe3+离子含量范围内，FS 的荧光强度与Fe3+离子浓度呈良好的线性关系(R2 = 0.9023)。
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