核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占有重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用[1, 2]。对核苷酸分子的选择性识别在对于探索多组分体系中的弱相互作用、揭示遗传信息的选择、学习模拟自然界中生物信息的表达等基础研究方面具有重要的理论价值，同时对研究开发具有靶向性的新型药物及合成具有应用前景的生物分子器件具有指导意义[3,4,5]。国内外很多学者对核苷酸识别的研究做了大量工作，Nobel奖得主J. M. Lehn教授[6]在大环多胺体系中实现了对三磷酸腺苷(ATP)的高选择性识别，并开创性地利用这种多位点的识别作用实现了对核苷酸水解过程的有效催化。韩国的Ju Yoyoung Yoon教授[7] 设计合成了一个钳状的核苷酸探针，在与ATP相互作用时，通过单线态与激发态(I375/I487)之间较大的荧光强度比达到了较高的选择性。在生理pH值下，借助正电荷大环体系的静电作用和强的芳环堆积的协同作用，Ramaiah教授[8]在吡啶蒽环蕃结构中实现了对三磷酸腺苷(ATP)的高选择性识别。
相对于传统的共价键分子容器，配位自组装 笼状配合物具有明显的优势，其拥有的尺寸和几 何形状一定的空穴，大量分枝、桥联和连接基团，不仅允许构建具有特殊动力学特征的给定结构，同时能够通过可复合多种底物或一个多功能底物的弱作用亚单元，实现对特殊物种多位点的高选择性识别[9,10,11]。近年来，日本学者M. Fujita教授和美国学者K. N. Raymond教授等[12,13,14,15,16]在金属有机笼状配合物的组装与功能化研究中作出了突出的贡献。
与传统的金属有机配合物相比，笼状金属有机配合物对配体的需求更加明确。笼状配合物中的配体，需要具有多个多齿配位中心，才可以与金属离子组装成为具有空间限域性的金属有机笼状配合物[17,18,19]。同时，为了降低组装的难度，通常选用具有较高对称性的有机配体。本课题组前期利用高对称性的三臂配体与Pd离子配位自组装，形成去顶的八面体结构，可以通过氢键作用和π-π堆积作用选择性包合尿苷分子[20]。本文选择设计了具有C3对称性的三臂有机配体H3 L2 ，H3 L2 具有较高的对称性，每条臂上具有一个两齿配位中心，可以有效地与多个金属离子进行配位。引进了具有光学活性的三苯胺基团，可以作为有效的光信号输出单元。通过与过渡金属离子配位自组装成两种具有四面体构型的正离子笼状配合物Zn- L2 /Co- L2 ，利用荧光作为主要的研究手段，核磁分析及电喷雾质谱等辅助，研究了笼状配合物在核糖核酸中对三磷酸腺苷选择性识别。
1 实验部分 1.1 仪器与试剂实验仪器：核磁测试采用美国Varian公司Varian INOVA 400核磁共振谱仪，1HNMR的频率为400 MHz，谱宽为10000 Hz，脉冲重复时间分别为10 s，脉冲角30°，温度25℃(TMS内标)；元素分析采用Vario EL III元素分析仪；单晶测试采用Bruker公司的Smart-CCD单晶衍射仪，Mo-K(射线波长为(λ= 0.71073 Å，结构采用SHELXTL 5.1直接法解出，对F2用最小二乘法精修；电喷雾质谱(ESI-MS)采用HPLC-Q-Tof MS测定，乙腈为流动相；荧光光谱采用Edinburgh instruments FS-920稳态荧光仪，激发和发射狭缝均为2 nm；紫外-可见吸收光谱采用TU 1900双光束紫外-可见分光光度计。
化学试剂：2-吡啶甲醛、高氯酸钴、高氯酸锌购于百灵威；对硝基苯胺、对硝基氯苯、对苯二甲酸、氯化亚锡购于国药集团化学试剂有限公司；溶剂分析纯，购于天津科密欧化学试剂有限公司，其中DMF用标准方法干燥。
1.2 配体H3 L2的合成(1)三(4-硝基苯基)胺
在150 mL三口圆底烧瓶中加入50 mL二甲基亚砜，再加入13.8 g对硝基苯胺(0.1 mol)、 47.1 g对硝基氯苯(0.4 mol)和55.2 g碳酸钾(0.4 mol)，145~150℃下反应12 h。反应结束后将反应混合液倒入冷水中，得到大量黄色固体，过滤，用水和丙酮清洗滤饼。得金黄色固体约7.9 g，产率72 %。
1HNMR (400 MHz,DMSO-d6): 8.25 (m,2Hbenzene),7.36 (m,2Hbenzene)。
(2)三(4-氨基苯基)胺
氮气条件下，在圆底烧瓶中先加入30 mL DMF，再加入1.9 g三(4-硝基苯基)胺(5 mmol)和11.28 g SnCl2·2H2O(50 mmol)。向溶液中逐滴加入含有0.57 g 硼氢化钠(15 mmol)的10 mL DMF溶液，60 ℃下反应4 h。反应结束后，倒入200 mL的1 mol/L氢氧化钠冰浴中，用1 mol/L的盐酸溶液中和至pH=9，抽滤得紫色固体。
1HNMR (400 MHz,DMSO-d6): 6.60 (d,2Hbenzene),6.45(d,2Hbenzene),4.71(s,2HNH2)。
(3) H3 L2
将0.3 g(4-氨基苯基)胺(1.03 mmol)溶于60 mL甲醇溶液中，加入0.4 g的2-吡啶甲醛(3.7 mmol)，滴入5滴冰醋酸，85℃下回流8 h。反应 结束后抽滤得0.52 g橙黄色固体，产率90%。熔点: 102.5.3~102.8 ℃。元素分析，理论(C36H27N7·6H2O): H 5.90,C 64.95,N 14.73%. 测试: H 5.95,C 64.91,N 14.68%。
 | 图1 配体H3 L2 的合成路线 Synthesis of ligand H3 L2 |
1HNMR (400 MHz,DMSO-d6): 8.72 (d,3Hpyridyl),8.67(s,3HCH=N),8.16 (d,3Hpyridyl),7.96(m,3Hpyridyl),7.52 (m,3Hpyridyl),7.43 (d,6Hbezene),7.15 (d,6Hbezene)。
1.3 配合物的合成(1)配合物Zn- L2 的合成
74.4 mg Zn(ClO4)2·6H2O (0.20 mmol)和111.4 mg H3 L2 (0.20 mmol) 溶于20 mL乙腈溶液，室温搅拌2 h，乙醚扩散得红色块状晶体，过滤干燥，产率为60 %。元素分析，理论Zn4(C36H27N7)4(ClO4)8(CH3CN)(H2O)3:H 3.49,C 51.58,N 12.01%; 测试:H 3.55,C 51.52,N 11.95%。
(2)配合物Co- L2 的合成
73.2 mg Co (ClO4)2·6H2O (0.20 mmol)和111.4 mg H3 L2 (0.20 mmol) 溶于20 mL乙腈溶液，室温搅拌2 h，乙醚扩散得红色块状晶体，过滤干燥，产率为60%。元素分析，理论 Co4(C36H27N7)4(ClO4)8(CH3CN)2(H2O)2: H 3.52,C 52.59,N 12.43%; 测试: H 3.59,C 52.55,N 12.40%。
1.4 晶体数据晶体数据在Bruker Smart APEX Ⅱ单晶衍射仪上用Mo靶(λ=0.71073 Å)通过SMART和SAINT程序进行收集，收集温度为273±2 K。晶胞精修是基于从这些72帧的所有观察到的衍射点。在SHELXTL-97上通过直接法和全矩阵最小二乘法得到结构的空间群为P2(1)/n。所有非氢原子进行各向异性处理。有机配位体上的氢原子经各向同性处理，而且包括在结构因子的计算中。其中晶体Co- L2 的结构数据为：C294H216Cl16Co8N59O72，Mr=6765.90,Monoclinic,P2(1)/n,a=15.7566(13) Å,b=30.326(3) Å,c=38.739(3) Å，α=90.00 °，β=98.731(5)°，γ=90.00°，V=18296(3) Å3,Z=2,Dc = 1.228 g·cm-3,μ=0.546 mm-1。23882个衍射点中有8739个独立衍射点(Rint = 0.2060)。R1 =0.1135，wR2(I≥2σ(I))= 0.3394，CCDC号为973384。其中晶体Zn- L2 的结构数据为：C290H216Cl16N56O68Zn8，Mr=6663.35,Monoclinic,P2(1)/n,a=15.763(10) Å,b=30.594(19) Å,c=38.39(2) Å，α= 90.00°，β= 99.439(8)°，γ=90.00°，V=18265(19) Å3,Z=2,Dc = 1.212 g·cm-3,μ=0.706 mm-1。23788个衍射点中有8677个独立衍射点(Rint = 0.2085)。R1=0.1373，wR2(I≥2σ(I))= 0.3453，CCDC号为973385。
1.5 笼状配合物的组装以三苯胺为母体衍生的三臂配体H3 L2 ，通过与过渡金属离子Zn2+、Co2+配位自组装，其中三臂配体的每个臂上含有一个二齿螯合配位点，而 Zn2+、Co2+是六配位的金属离子，组装后形成[4+4] 的带有正电荷的四面体笼状配合物Zn- L2 、Co- L2 。其中，四个金属离子位于四面体的四个顶点，每个三臂配体位于四面体的一个面，形成的四面体配合物的每个边有一定的孔道大小，可以允许客体分子进出。
单晶X-射线结构分析表明，笼状配合物为四面体构型，单斜晶系，空间群为P2(1)/n。如图2所示，每一个具有正电荷的四面体笼状配合物具有C3对称性，每个配体H3 L2 位于C3对称轴的垂直位置，三个相同的NN两齿螯合配位点分别与 三个不同的金属离子中心配位。四个金属中心位于C3对称轴上，每一个金属离子Zn2+/Co2+分别与三个不同配体的两齿螯合配位点配位。其中，在四面体Zn- L2 中，Zn-N(吡啶)和Zn-N(氨基)的键长分别为2.1054(11) Å和2.1470(9) Å。Zn-Zn之间的距离大约11.9 Å，四面体Zn- L2 菱形窗口面积为40.46 Å2，内部空间体积约为198.56 Å3。在四面体Co- L2 中，Co—N(吡啶)和Co—N(氨基)的键长分别为2.0959(1) Å 和2.1505(1) Å。Co—Co之前的距离大约11.8 Å，四面体Co- L2 菱形窗口面积为39.94 Å2，内部空间体积约为193.60 Å3。
 | 图2 配体H3 L2 的结构及Zn- L2 /Co- L2 的构筑 Structures of ligand H3 L2 and the constructional fragments of Zn- L2 /Co- L2 |
图3为核苷酸的荧光滴定图，在CH3CN/H2O=1/1(V/V)的混合溶剂中，研究四面体配合物Zn- L2 对核苷酸的荧光识别作用。在310 nm处激发，笼状配合物Zn- L2 (10 μmol/L)的荧光在440 nm出现三苯胺的荧光特征发射峰。当向溶液中滴加三磷酸腺苷ATP分子时，配合物Zn- L2 的荧光显著增强。加入三磷酸腺苷ATP的量至15倍(150 μmol/L)，荧光增强达到平衡，荧光强度约为原来的6倍。根据在440 nm处荧光滴定的Hill-plot曲线计算，形成1∶1的主客体配合物，络合常数logKass为4.37±0.19 [21]。向含有配合物Zn- L2 (10 μmol/L)的CH3CN/H2O=1/1(V/V)的混合溶剂中滴加其他核苷酸分子至过量(200 μmol/L)，配合物Zn- L2 的荧光并无明显变化。四面体Zn- L2 可以与三磷酸腺苷ATP分子相互作用，使得配合物Zn- L2 的荧光增强，但是对其他的核苷酸阴离子并无明显的作用，Zn- L2 对ATP分 子的荧光响应效果高于其他核苷酸分子响应约500%，说明配合物Zn- L2 对三磷酸腺苷ATP具有专一的选择性荧光识别。
 | 图3 配合物Zn- L2 对ATP的荧光滴定曲线(左)和对于不同核苷酸的荧光响应(右) Fluorescence family of Zn- L2 in CH3CN/H2O=1/1(V/V) upon the addition of ATP (left) and respective responses of Zn- L2 upon the addition of different nucleotide (right) |
如图4所示，在CH3CN/H2O=1/1(V/V)的混合溶剂中，笼状配合物Zn- L2 (10 μmol/L)的紫外可见光谱在290 nm和430 nm有两处明显的吸 收峰。当向溶液中滴加三磷酸腺苷ATP直至过量(200 μmol/L)，紫外可见光谱均无明显变化，向含有配合物Zn- L2 (10 μmol/L)的溶液中加入其他的核苷酸阴离子紫外可见光谱也不发生变化。三磷酸腺苷ATP可以使配合物Zn- L2 的荧光增强， 但是紫外可见并无明显变化，说明四面体Zn- L2 对 三磷酸腺苷ATP的识别过程是一个PET机理的识别过程。进一步研究了配合物Zn- L2 在生理pH范围下的稳定性，在310 nm处激发，在不同的生理pH(5.5～9.0)值下，笼状配合物Zn- L2 (10 μmol/L)在440 nm处的荧光发射光谱无明显变化。当有过量(200 μmol/L)的ATP分子存在时，体系的荧光发射光谱在不同的生理pH(5.5～9.0)值下仍无明显变化。测试表明在生理pH值范围下，配合物Zn- L2 及有三磷酸腺苷ATP存在体系的荧光信号都十分稳定。
 | 图4 配合物Zn- L2 对核苷酸的紫外响应(左)和配合物Zn- L2 及含有过量ATP的配合物Zn- L2 的pH稳定性(右) UV-Vis responses of Zn- L2 upon the addition of nucleotides (left) and the pH stability of Zn- L2 and Zn- L2 upon the addition of the excess ATP(right) |
为了进一步研究四面体笼状配合物与ATP分子之间的相互作用，对配合物和ATP的核磁共振谱图进行了研究(图5)。在含有2 mmol/L的Zn- L2 的CD3CN溶液中加入一倍量(2 mmol/L)的ATP分子时，在7.0 ppm和6.0 ppm处分别出现两组新峰，这说明配合物Zn- L2 与三磷酸腺苷分子ATP之间存在主客体化学作用。在核磁磷谱的研究中，当向含有1.5 mmol/L Zn- L2 的d6-DMSO/D2O=8/2(V/V)溶液中加入一倍量1.5 mmol/L的ATP分子时，三磷酸腺苷中磷的出峰位置发生明显的改变，说明笼状配合物Zn- L2 与ATP分子之间存在主客体化学作用。
 | 图5 在CD3CN中ATP的核磁氢谱(上)；笼状配合物Zn- L2 加一倍ATP的核磁氢谱(中)；配合物Zn- L2 的核磁氢谱(下) 1HNMR spectra of ATP (top); 1HNMR spectra of Zn- L2 upon 1eq ATP (middle); 1HNMR spectra of Zn- L2 in CD3CN(bottom) |
进一步选用电喷雾质谱(ESI-MS)对笼状配合物和三磷酸腺苷之间的主客体化学作用进行研究(图6)，相对于四面体笼状配合物Zn- L2 ，配合物Co- L2 在电喷雾质谱中稳定性较强，所以选取Co- L2 进行研究。四面体配合物Co- L2 为阳离子笼状配合物，测试采用正模式。检测含有0.2 mmol/L Co- L2 的乙腈溶液，在质荷比为715.65和987.86处有两处明显的质谱分子离子峰，经同位 素模拟分别可以归属为[(Co L2 )4(ClO4)4]4+和[(Co L2 )4 (ClO4)5]3+。当向体系中加入一倍量的 三磷酸腺苷ATP分子(0.2 mmol/L)时，在质荷比为860.26和1179.98处分别出现两组新的质谱分子离子峰，经同位素模拟分别可以归属为[(Co L2 )4(ClO4)3(ATP)·(CH3CN)]4+和 [(Co L2 )4(ClO4)4(ATP)·(CH3CN)]3+。
 | 图6 配合物Co- L2 的电喷雾质谱(左)和Co- L2 包合ATP分子的电喷雾质谱(右) ESI-MS of Co- L2 (left) and Co- L2 in the presence of ATP (right) |
金属有机笼状配合物在生物小分子识别中占有重要优势，本文设计合成的有机配体H3 L2 具有高度对称性并含有多齿螯合配位点，可以有效地与过渡金属ZnII/CoII作用，形成四面体构型的金 属有机笼状配合物Zn- L2 和Co- L2 。同时配体H3 L2 含有荧光基团三苯胺，使得四面体配合物具有光学活性。配合物Zn- L2 和Co- L2 均为阳离子配合物，可以有效地与生物阴离子作用，以荧光为输出信号，选择性识别三磷酸腺苷ATP分子。
| [1] | Huang X B, Xu Y, Zheng L F, Meng J, and Cheng Y X. A highly selective and sensitive fluorescence chemosensor based on optically active polybinaphthyls for Hg2+[J]. Polymer, 2009, 50(25): 5996-6000. |
| [2] | Zhang L, Lou X D, Yu Y, Qin J G, and Li Z. A new disubstituted polyacetylene bearing pyridine moieties: convenient synthesis and sensitive chemosensor toward sulfide anion with high selectivity[J]. Macromolecules, 2011, 44(13): 5186-5193. |
| [3] | Tong H, Wang L X, Jing X B, and Wang F S. "Turn-on" conjugated polymer fluorescent chemosensor for fluoride ion[J]. Macromolecules, 2003, 36(8): 2584-2586. |
| [4] | Zhu L N, Qin J G, and Yang C L. Synthesis, photophysical properties, and self-assembly behavior of amphiphilic polyfluorene: unique dual fluorescence and its application as a fluorescent probe for the mercury ion[J]. Journal of Physical Chemistry B, 2010, 114(46): 14884-14889. |
| [5] | Kimura M, Horai T, Hanabusa K, and Shirai H. Fluorescence chemosensor for metal ions using conjugated polymers[J]. Advanced Materials, 1998, 10(6): 459-462. |
| [6] | Opris D M, Ossenbach A, Lentz D, and Schlüter A D. A set of homologous hetarylenediyne macrocycles by oxidative acetylene-acetylene coupling[J]. Organic Letters, 2008, 10(11): 2091-2093. |
| [7] | Alvarez-Diaz A, Salinas-Castillo A, Camprubi-Robles M, Costa-Fernandez J M, Pereiro R, Mallavia R, and Sanz-Medel A. Conjugated polymer microspheres for "turn-off"/"turn-on" fluorescence optosensing of inorganic ions in aqueous media[J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(7): 2712-2718. |
| [8] | Bao Y Y, Li Q B, Liu B, Du F F, Tian J, Wang H, Wang Y X, and Bai R K. Conjugated polymers containing a 2,2'-biimidazole moiety: a novel fluorescent sensing platform[J]. Chemical Communications, 2012, 48(1): 118-120. |
| [9] | Smith R C, Tennyson A G, Lim M H, and Lippard S J. Conjugated polymer-based fluorescence turn-on sensor for nitric oxide[J]. Organic Letters, 2005, 7(16): 3573-3575. |
| [10] | He G, Yan N, Cui H, Liu T H, Ding L P, and Fang Y. A quinoline-containing conjugated polymer-based sensing platform for amino acids[J]. Macromolecules, 2011, 44(18): 7096-7099. |
| [11] | 姜凤超,陈建国,王 悦,周 平,曹宝帅. 2-氨基噻唑衍生物及制备方法和应用.中国专利, 102336720. 2012-02-01. Jiang F C, Chen J G, Wang Y, Zhou P, Cao B S. 2-Aminothiazole derivative, its preparation and medical application. China patent, 102336720. 2012-02-01. |
| [12] | Zeng Q, Lam J W Y, Jim C K W, Qin A J, Qin J G, Li Z, and Tang B Z. New chemosensory materials based on disubstituted polyacetylene with strong green fluorescence[J]. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 2008, 46(24): 8070-8080. |
| [13] | Ou D X, Qin J G, and Li Z. A new disubstituted polyacetylene bearing DDTC moieties: postfunctional synthetic strategy, selective and sensitive chemosensor towards mercury ions[J]. Polymer, 2012, 53(25): 5691-5698. |
| [14] | Ou D X, Zhang L, Huang Y F, Lou X D, Qin J G, and Li Z. A new disubstituted polyacetylene bearing 6-benzylaminopurine moieties: postfunctional synthetic strategy and sensitive chemosensor towards copper and cobalt ions[J]. Macromolecular Rapid Communications, 2013, 34(9): 759-766. |