采用巯基丙酸(mercaptopropionic acid,MPA)作为修饰剂制备水溶性CdTe量子点时，由于MPA属于短链巯基酸，具有较强的钝化作用，可在量子点表面形成稳定的配体层，使量子点粒径小、稳定性高，但是量子点生长速度较慢，获得长发射波长所需时间较长。为此，有必要引入其他巯基化合物作为修饰剂调控量子点生长趋势和速率，提高量子点的荧光性能和稳定性。

L-半胱氨酸(L-cysteine,L-Cys)是一种同时带氨基、羧基和巯基的氨基酸，具有较强的亲水性。L-Cys作为修饰剂调控量子点生长过程的研究已有报道^[13]。L-Cys可明显提高量子点的生长速率，并且量子点表面具有丰富的羧基和氨基，可通过共价或非共价的方法与其他生物大分子偶联。L-Cys修饰的量子点表面带正电荷，可直接或间接用于标记DNA或作为基因载体运载基因。但L-Cys稳定性差，易水解和氧化，使量子点表面的配体层遭到破坏，导致量子点失去荧光甚至发生分解。

鉴于L-Cys和MPA各自的优缺点，本文提出了以两者为混合修饰剂共同修饰量子点，通过调节L-Cys与MPA的摩尔比来调控量子点的生长速率和改善荧光性能的方法。与单一修饰剂L-Cys或MPA相比，L-Cys/MPA作为共修饰剂可明显加快CdTe量子点生长速率，提高荧光稳定性，延长荧光寿命。进一步将其用于人宫颈癌细胞(SiHa细胞)标记，结果表明量子点能有效地对SiHa细胞进行荧光标记。L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点具有良好的荧光特性和生物相容性，在生物医药领域具有重要的应用价值。 1 实验部分 1.1 试剂与仪器

Te粉(分析纯，国药集团)，NaBH₄(分析纯，国药集团)，CdCl₂·2.5H₂O(分析纯，国药集团)，L-Cys(分析纯，国药集团)，MPA(分析纯，Sigma公司)，罗丹明6G(分析纯，Sigma公司)，异丙醇(分析纯，国药集团)，DMSO(分析纯，国药集团)，EDTA(分析纯，国药集团)，MTT(分析纯，Sigma公司)，多聚甲醛(分析纯，国药集团)，胎牛血清(HyClone公司)，DMEM培养基(HyClone公司)，胰酶(HyClone公司)，人宫颈癌细胞SiHa细胞(本实验室传代保存培养),Hoescht 33342(Sigma公司)。

自配溶液：PBS缓冲液；0.25%胰酶溶液(含10%胎牛血清的DMEM溶液)；0.02%EDTA溶液；5 mg/mL MTT溶液；4%多聚甲醛溶液。实验用水为双蒸水。

实验仪器包括Lambda 35型紫外-可见分光光度计(美国PerkinElmer)，QM/TM型稳态/瞬态荧光光谱仪(美国 PTI)，ZF-1三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)，D/max-2550 PC型X射线多晶衍射仪(日本 Rigaku)，JEOL JEM-2100型透射电子显微镜(日本 JEOL)，MultiSkan FC酶标仪(美国Thermo Scientific)，Carl Zeiss LSM 700激光共聚焦显微镜(德国Jena)。 1.2 制备方法

NaHTe的制备：将一定量的Te粉、NaBH₄和双蒸水12 mL加入烧瓶中，N₂保护下，60 ℃下恒温水浴反应30 min左右，待Te粉完全溶解后，溶液呈淡紫红色透明状，即制得NaHTe溶液。L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点的制备：称取0.125 mmol CdCl₂·2.5H₂O、0.3 mmol L-Cys/MPA溶于98 mL双蒸水中，用1 mol/L的NaOH调pH，通氮气脱氧30 min得到MPA-Cd²⁺前驱液。取新鲜制备的NaHTe溶液2 mL，迅速加入到剧烈搅拌的MPA-Cd²⁺溶液中得到CdTe量子点前驱液，脱氧10 min后于100 ℃油浴下加热回流反应一定时间即得到橙黄色CdTe胶体溶液。将其浓缩至原体积的1/4，逐滴加入异丙醇后离心得到沉淀，将该沉淀复溶于一定体积的双蒸水中备用^[14]。L-Cys与MPA摩尔比分别为100%、75%、50%、25%、0%，为表述方便，将其分别记为100L、75L、50L、25L、0L。 1.3 L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点的表征

利用紫外分光光度计检测量子点的紫外吸光度，稳态荧光光谱仪测定量子点的荧光发射光谱，利用瞬态荧光光谱仪扫描量子点的荧光寿命衰减曲线，透射电镜观察量子点粒径及分散情况，X射线多晶衍射仪确定量子点晶体结构。 1.4 相对荧光量子产率测定

相对荧光量子产率是根据文献中的报道得到的^[15]，以罗丹明6G为参比(量子产率为95%)，以425 nm为激发波长，调节样品和参比溶液浓度使其在该激发波长下的吸光度小于0.06，再分别测定两者的荧光发射光谱，根据下面的公式进行计算：

在避光条件下将量子点原液暴露于紫外灯下(254 nm,365 nm)，每隔5 min扫描荧光发射光谱记录每个采样点的荧光强度，并绘制荧光强度随紫外光照时间的衰减曲线以考察抗紫外光稳定性。 1.6 量子点用于细胞标记 1.6.1 细胞培养

将SiHa细胞培养于含10%(体积比)胎牛血清的高糖DMEM培养液中。培养箱中CO₂浓度保持在5%，温度保持在37℃。当细胞长满一层后，用含0.25%胰酶和0.02% EDTA的消化液消化、传代。 1.6.2 量子点细胞毒性测试(MTT实验)

选取对数生长期SiHa细胞，消化，离心收集细胞，制备成细胞悬浮液计数调整细胞密度为2×10⁴ 个/mL，接种到96孔培养板中，每孔加200 μL细胞悬液，细胞数约为4000 个/孔。每组设6个平行孔，重复两次，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。20 h细胞贴壁后，吸去上清液，加入新的培养液，同时加入浓度分别为10、25、50、100 μg/mL的四种量子点PBS缓冲溶液，四种量子点分别为75L-CdTe(λ_em=615 nm)，75L-CdTe(λ_em=597 nm)，50L-CdTe(λ_em=585 nm)，50L-CdTe(λ_em=579 nm)。另外设一个对照组(不加任何量子点溶液)。上述不同处理的细胞培养液在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养48 h。实验终止前4 h每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h。吸去培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，使深蓝色沉淀物充分溶解，用酶标仪测定各孔在570 nm波长下的吸光度，并计算细胞存活率。 1.6.3 量子点应用于细胞标记

选取对数生长期SiHa细胞，消化，离心收集细胞，制备成细胞悬浮液。将细胞接种于放有盖玻片的培养皿中，细胞密度以5×10⁴个/mL为宜，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养20 h细胞贴壁后，吸去上清液，加入浓度为10 μg/mL的75L-CdTe量子点(λ_em=615 nm)PBS缓冲溶液，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养4 h。取出培养皿，吸去培养液，用1 mL PBS缓冲液洗3次，每次浸泡1 min。然后加入500 μL 4%多聚甲醛溶液，4 ℃下固定10 min，吸去多聚甲醛溶液，用1mL PBS缓冲液浸泡3次。加入1 μg/mL的Hoescht 33342，覆盖细胞，37 ℃下对细胞核染色15 min。将Hoescht 33342吸出，用PBS缓冲液洗3次。向载玻片上滴一滴0.9%的甘油，将盖玻片挑出，晾干后放置于甘油上，使盖玻片上长有细胞的一面朝向甘油放置，用指甲油封口，晾干。在激光共聚焦荧光显微镜下观察量子点被细胞的摄取及分布情况。 2 结果和讨论 2.1 L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点紫外吸收和荧光发射光谱比较

按照上述方法成功合成了以L-Cys/MPA共修饰的CdTe量子点。通过改变修饰剂的种类、配比以及调控反应时间，可以得到一系列从绿到红的荧光量子点。图1为L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点的紫外吸收和荧光发射光谱。由图1(A)可知，100 ℃下回流反应相同时间(120 min)，0L-CdTe的紫外吸收值为455 nm，随着L-Cys量增加，量子点的紫外吸收峰逐渐向长波长方向移动，100L-CdTe的紫外吸收峰对应的波长为486 nm。L-Cys与MPA不同摩尔比下得到的CdTe 吸收光谱中第一激子吸收峰(量子限域峰)均为明显的结构化峰。由图1(B)可知，相同的回流时间下，0L-CdTe的荧光发射峰为513 nm，随着L-Cys量增加，量子点的荧光发射峰逐渐向长波长方向移动，100L-CdTe的荧光发射峰对应波长为568 nm。L-Cys与MPA不同摩尔比制备的CdTe其荧光发射峰呈高斯分布，基本对称且无拖尾，表明体系中的CdTe量子点粒径分布窄、大小均一。

图 1

Fig. 1

图1 L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点的紫外吸收光谱(A)和荧光发射光谱(B)，a~e分别表示0L-CdTe、25L-CdTe、50L-CdTe、75L-CdTe、100L-CdTe The absorption spectrum (A) and emission spectrum (B) of CdTe QDs using L-Cys/MPA as mixed-ligands, a-e indicate 0L-CdTe,25L-CdTe,50L-CdTe,75L-CdTe,100L-CdTe,respectively

图2表明L-Cys/MPA作为共修饰剂，调节MPA与L-Cys的摩尔比可明显影响CdTe量子点荧光发射光谱红移速率(即向长波长方向移动的速率)。L-Cys与MPA摩尔比为100%时量子点红移速率最快，随着MPA量增加，量子点紫外吸收峰和荧光发射峰的红移速率逐渐减慢。反之，L-Cys量的增加会加快量子点红移速率。红移速率越快，即向长波长方向移动的速率越快，说明量子点成核生长的速率越快。上述结果表明，与L-Cys相比，MPA作为修饰剂不利于量子点成核 生长。MPA是一种较稳定的修饰剂，量子点成核后，MPA通过巯基和表面Cd原子配位结合，在量子点表面形成一层致密的吸附层，构成量子点外电荷，维持量子点在水溶液中的稳定。L-Cys的化学结构虽然与MPA相近，但其结构中含有的亲核性基团氨基使其具有与TGA相似的二级配位能力。这种二级配位能力会导致前驱液中CdTe纳米晶的聚集，从而使得在加热回流反应中量子点的成核生长速率加快，量子点粒径变大，粒径分布变宽^[16]。

图 2

Fig. 2

图2 L-Cys/MPA不同摩尔比对CdTe量子点荧光发射峰 红移速率的影响，a~e分别表示100L-CdTe、75L-CdTe、50L-CdTe、25L-CdTe、0L-CdTe Time evolution of peak emission wavelength of CdTe QDs when L-Cys and MPA were employed in combination with different molar ratios,a-e indicate 100L-CdTe,75L-CdTe, 50L-CdTe,25L-CdTe,0L-CdTe,respectively

Peng等总结出的估算CdTe量子点粒径尺寸D(nm)的经验公式^[17]:D=9.8127×10^-7λ³-1.7147×10^-3λ²+1.0064λ-194.84,式中λ为样品第一激子吸收峰的波长。根据量子点紫外吸收光谱和上述公式，计算得到了不同回流时间内量子点的粒径大小并列于表1。由表1可知，回流60~300 min内,CdTe量子点的粒径始终满足D(100L-CdTe)>D(75L-CdTe)>D(50L-CdTe)>D(25L-CdTe)>D(0L-CdTe)，说明以L-Cys作为修饰剂更容易获得粒径较大的量子点，以MPA为修饰剂则容易获得粒径小的量子点，以L-Cys/MPA为共修饰剂得到的量子点粒径大小适中。量子点粒径大小反映在荧光波长上的规律是粒径越大荧光发射波长越长，因此上述结果表明，通过增加L-Cys的比重可以在较短时间内获得荧光发射波长较长的量子点。

表1

Table 1

表1

表1 回流300 min内L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点粒径尺寸D(通过公式计算得到，单位：nm) Diameters of CdTe QDs using L-Cys/MPA as mixed-ligands within refluxing time of 300 min 回流时间/min D(0L-CdTe) D(25L-CdTe) D(50L-CdTe) D(75L-CdTe) D(100L-CdTe) 15 0.23 - 0.52 0.25 - 30 0.73 0.68 0.89 1.18 1.36 60 1.04 1.18 1.32 1.72 2.40 120 1.27 1.36 1.56 2.11 3.01 180 1.44 1.61 2.17 2.53 3.20 240 1.53 1.94 2.45 2.77 3.41 300 1.69 1.98 2.76 2.95 3.63

表1 回流300 min内L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点粒径尺寸D(通过公式计算得到，单位：nm) Diameters of CdTe QDs using L-Cys/MPA as mixed-ligands within refluxing time of 300 min

图3为L-Cys与MPA不同摩尔比对CdTe荧光量子产率的影响，不同发射波长的CdTe量子点均在回流300 min内制备得到。0L-CdTe具有最大的荧光量子产率73.2%，但发射波长较短，范围为501~534 nm；50L-CdTe的最大荧光量子产率为66.4%，发射波长范围为506~540 nm；75L-CdTe的最大荧光量子产率为60.6%，发射波长覆盖范围为519~575 nm。对于100L-CdTe，虽然其发射波长从511 nm红移到627 nm，但其最大量子产率只有54%。增加MPA比例可以提高CdTe荧光量子产率，这说明MPA作为修饰剂其末端巯基能很好地与量子点通过配位作用结合从而钝化其表面的缺陷。增加L-Cys的量虽然可以在较短时间内获得发射波长较长的量子点，但由于L-Cys较弱的钝化能力反而使荧光量子产率降低。因此与单一修饰剂相比，以L-Cys和MPA为混合修饰剂时，通过调节两者配比到合适水平，可以兼顾量子点的荧光量子产率和发射波长红移速率，避免回流时间太长而导致荧光性能降低。

图 3

Fig. 3

图3 L-Cys/MPA共修饰CdTe的荧光量子产率，a~e分别表示 Quantum yield versus emission wavelength peak of CdTe QDs using L-Cys/MPA as mixed-ligands,a-e indicate 100L-CdTe, 75L-CdTe,50L-CdTe,25L-CdTe,0L-CdTe,respectively

图4为L-Cys与MPA不同摩尔比对量子点荧光稳定性的影响。紫外光照射200 min内，0L-CdTe荧光强度变化幅度最小，100L-CdTe荧光强度下降最明显，25L-CdTe的荧光稳定性接近于0L-CdTe。L-Cys与MPA摩尔比为50%时量子点荧光强度在前180 min变化幅度较小，接近于0L-CdTe和25L-CdTe，且前50 min内荧光强度有所增加，而在180 min后下降较快，但仍然比100L-CdTe和75L-CdTe荧光强度下降幅度小。一方面说明MPA作为修饰剂可在量子点表明形成一层紧密稳定的分子层，有效弥补量子点表面缺陷。另一方面，50L-CdTe量子点在紫外光照射前50 min荧光强度增加可能是因为少量L-Cys发生光分解释放出的S^2-与CdTe表面的Cd²⁺配位结合形成CdS壳层并包裹在CdTe表面，CdS的包覆可提高CdTe量子点在发光初期的光致发光效率^[18]。但随着紫外光照射时间的增加，大部分L-Cys发生分解，量子点表面稳定层被破坏，溶液中开始出现沉淀。上述结论说明L-Cys作为单一修饰剂不利于量子点荧光稳定性的提高，而以L-Cys/MPA为混合修饰剂，调节L-Cys与MPA摩尔比为25%可明显改善量子点的荧光稳定性。

图 4

Fig. 4

图4 L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点的荧光稳定性，a~e分别表示100L-CdTe、75L-CdTe、50L-CdTe、25L-CdTe、0L-CdTe Photostability measurement of CdTe QDs capped with mixed stabilizing ligands of L-Cys and MPA,a-e indicate 100L-CdTe, 75L-CdTe,50L-CdTe,25L-CdTe,0L-CdTe,respectively

图5为L-Cys/MPA共修饰CdTe的荧光寿命衰减曲线(λ_ex=481 nm)。衰减曲线可通过双指数曲线模型拟合，该模型公式为:F(t)=A+B₁exp(-t/τ₁)+B₂exp(-t/τ₂),其中τ₁和τ₂代表寿命常数，B₁和B₂代表快组分和慢组分的百分比。引入平均寿命τ来比较体系中各量子点的寿命，其计算公式为τ=(B₁τ₁²+B₂τ₂²)/(B₁τ₁+B₂τ₂)。表2为对寿命衰减曲线拟合后得到的B₁、τ₁、B₂、τ₂、τ。

由表2可知，相比于单一修饰剂(L-Cys或MPA)，L-Cys/MPA共修饰量子点(75L-CdTe)的荧光寿命明显增加，最长寿命值为46.8 ns，明显优于Liu等的报道^[19]。原因可能是L-Cys/MPA作为共修饰剂，两者可相互弥补其缺陷从而为激发态电子提供一个更稳定的环境，促使荧光寿命的延长。说明L-Cys/MPA作为共修饰剂，通过调节两者的摩尔比例可有效减缓量子点的荧光衰减速率，延长其荧光寿命。

图 5

Fig. 5

图5 L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点的荧光寿命衰减曲线， a~e分别表示75L-CdTe、50L-CdTe、100L-CdTe、 0L-CdTe、25L-CdTe Luminescence decay curves of CdTe QDs capped with mixed stabilizing ligands of L-Cys and MPA,a-e indicate 75L-CdTe, 50L-CdTe,100L-CdTe,0L-CdTe,25L-CdTe,respectively

表2

Table 2

表2

表2 L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点的寿命参数 Luminescence lifetime parameters of CdTe QDs capped with mixed stabilizing ligands of L-Cys and MPA 样品 B1 /% τ1 /ns B2/% τ2 /ns τ/ns 0L-CdTe 52.3 19.2 47.7 41.0 33.6 25L-CdTe 53.4 17.3 46.6 30.8 25.5 50L-CdTe 52.7 22.6 47.3 56.9 46.4 75L-CdTe 51.5 23.7 48.5 57.0 46.8 100L-CdTe 51.9 24.7 48.1 55.4 45.4

表2 L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点的寿命参数 Luminescence lifetime parameters of CdTe QDs capped with mixed stabilizing ligands of L-Cys and MPA

图6(A)是75L-CdTe量子点(λ_em=615nm)的透射电镜图，从图中可以看出，制备的量子点具有良好的分散性、且大小分布均匀，形貌呈规则的球状，粒径大小约为4.0 nm左右，与根据第一激子吸收波长算出的结果相比稍大，这可能是因为在量子点表面混合修饰剂形成了一层较为致密的包裹层，使得粒径稍大；也可能是因为L-Cys热分解释放出少量的S^2-从而与量子点表面的Cd²⁺配位结合形成CdS壳层并包裹在CdTe表面^[20]，这一结论在下面的XRD分析中得到印证。图6(B)为XRD图谱，在2θ为24.5°、40.6°、47.7°处出现3个衍射峰，分别对应于CdTe立方晶系的(111)、(220)、(311)3个晶面，与文献报道基本一致^[21]。由于量子点的粒径很小，因而衍射峰有所展宽。与CdTe量子点体相材料的衍射峰位相比，75L-CdTe量子点的衍射峰位向CdS晶相偏移，说明在量子点生长过程中，L-Cys中的巯基发生热分解释放出少量的S^2-与量子点表面的Cd²⁺配位结合形成CdS壳层并包裹在CdTe表面^[20]。

图 6

Fig. 6

图6 75L-CdTe量子点(发射波长为615 nm)透射电镜图(A)和XRD图(B) TEM image (A) and XRD pattern (B) of 75L-CdTe QDs (λem=615 nm)

图7为发射波长为570~620 nm的量子点(75L-CdTe和50L-CdTe)对SiHa细胞毒性的影响。由图可知，量子点对细胞毒性不仅与其浓度有关，还与粒径尺寸和表面特性有关系。四种量子点浓度为10 μg/mL和25 μg/mL时，细胞存活率介于80%~95%。量子点浓度增加到50 μg/mL时，其对细胞的毒性也增强。量子点浓度为100 μg/mL时，细胞存活率最低，50L-CdTe量子点(λ_em=579 nm)的细胞存活率只有63%。四种量子点中发射波长615 nm的75L-CdTe在四种浓度10、25、50、100 μg/mL下的细胞存活率均高于其他三种量子点。由此可知浓度为10 μg/mL的75L-CdTe量子点(λ_em=615 nm)对细胞毒性较小，可用于细胞标记。

图 7

Fig. 7

图7 SiHa细胞与不同浓度量子点共培养48 h后的细胞存活率，量子点浓度分别为10、25、50、100 μg/mL；a~d分别为 75L-CdTe(λem=615 nm)，75L-CdTe(λem=597 nm)， 50L-CdTe(λem=585 nm)，50L-CdTe(λem=579 nm) Cell viability of SiHa cells treated with QDs with different concentrations for 48 h,a-d indicate 75L-CdTe(λem=615 nm)， 75L-CdTe(λem=597 nm)，50L-CdTe(λem=585 nm)，50L-CdTe (λem=579 nm),respectively

图8为SiHa细胞与量子点共培养4 h后的荧光共聚焦显微图像，所用量子点为75L-CdTe，发射波长615 nm，浓度为10 μg/mL。由图可看出，75L-CdTe量子点与细胞孵育结合4 h后，量子点吸附到细胞膜上并逐渐进入细胞质，均匀分布在细胞内，使整个细胞出现红色荧光，这与细胞核的蓝色荧光形成明显的对比。量子点标记后的细胞保持单细胞的轮廓，且细胞形态规则均一，未发生显著变化，表明75L-CdTe量子点荧光性质稳定且生物相容性好，可以用于细胞标记。另外，L-Cys/MPA共修饰的量子点表面富含氨基和羧基，容易通过共价或非共价方式接枝多种类型的功能分子，来提高量子点在细胞标记中的应用潜力。

图 8

Fig. 8

图8 75L-CdTe量子点(λem=615 nm)对SiHa细胞荧光标记图像 Cellular uptake of the as-prepared 615 nmemitting 75L-CdTe QDs

本文制备了L-Cys/MPA共修饰的水溶性CdTe量子点，通过改变L-Cys与MPA的摩尔比可以在较短时间内获得粒径均一、荧光量子产率高、荧光寿命长的量子点。以MPA和L-Cys为共修饰剂制备的CdTe量子点具有较快的成核生长速率，并且荧光性能好，生物毒性低。将量子点作为荧光探针标记SiHa细胞，结果表明量子点能有效地对SiHa细胞进行荧光标记。L-Cys/MPA共修饰CdTe量子点具有良好的荧光特性和生物相容性，其表面的羧基和氨基可进一步通过共价或非共价方式偶联其他生物大分子，在生物医药开发方面具有重要意义。