蛋白质、核酸、多糖等大分子物质在细胞内的浓度很高，使得细胞内的环境是高度拥挤的，大分子在细胞内的浓度可高达80~400 g/L^[1]，能占细胞总容积的20%~30%^[2]，由于排斥容积效应，任何可增加可用容积的反应都能被大分子拥挤试剂刺激发生^[3,4,5,6]。在生物体内，大多数的生化反应都是在这种高度拥挤的环境中完成的，当蛋白存在于大分子拥挤环境中时，其微环境会发生改变，使得蛋白的结构及稳定性发生变化^[2,7]，从而使得蛋白的功能表达在拥挤试剂和稀溶液中不同。

生命体的重要组成部分——血红素类蛋白，在生命体中承担着极其重要的功能，例如作为生物催化剂、电子传递蛋白、氧载体和生物传感器等^[8]。由于血红素类蛋白含有原卟啉Ⅸ辅基，故其能够吸收特定波长的光，光照通过影响血红素功能的表达而影响蛋白功能。关于光照射血红素类蛋白的研究已有报道，如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素P450、细胞色素C、细胞色素C氧化酶和辣根过氧化物酶等^{[9,10,11,12,13,14]}，但是这些研究是在稀溶液中进行的，忽略了生物体细胞内的拥挤环境。目前关于血红素类蛋白在高度拥挤环境下光照的研究还很少。

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是以铁卟啉为辅基的血红蛋白，辣根过氧化物酶能利用过氧化氢氧化一些有机和无机化合物，它与植物的呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都紧密相关，而且对氧自由基具有消除作用，减少过氧化物对植物体的毒害作用。辣根过氧化物酶在生物传感器^[15]、环境监测、工业应用^[16]等方面也发挥了很大的作用，广泛地运用于基因学、生理学及病理学研究中^[17,18]。

我们最近研究了紫外-可见光诱导细胞色素C、高铁肌红蛋白^[19,20]和HRP的还原及其机制，发现它们的光还原反应机制都是光诱导分子内电子转移。为了进一步了解光诱导血红素蛋白在细胞内环境中的还原过程，本文通过在光照体系中加入大分子拥挤试剂来模拟细胞内环境，研究了该条件下光诱导HRP的还原，利用紫外-可见吸收光谱、同步荧光光谱及圆二色谱等方法对拥挤环境中光照射HRP后其血红素中铁原子价态、蛋白构象及二级结构的变化进行了研究，确定了拥挤环境中HRP的最适光还原条件，分析了光照波长、温度、拥挤试剂浓度等对HRP光还原的影响。

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)样品购自美国Sigma公司，使用时未经进一步提纯，溶解在0.05 mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ 缓冲溶液(pH=7.4)中，配置成浓度为5×10^-4 mol/L的蛋白溶液，蛋白溶液冷冻避光保存并尽快应用于实验。

Dextran70和Ficoll70购自上海生工公司，分别将大分子拥挤试剂Dextran70和Ficoll70溶解到pH 7.4的PB缓冲溶液中，使其终浓度达到50 g/L、100 g/L、200 g/L和400 g/L，实验用水为去离子水。

实验仪器主要有UV-Vis分光光度计(V-560，日本Jasco公司)，荧光光谱仪(FP-6500，日本Jasco公司)和圆二色光谱仪(J-810，日本Jasco公司)，制冷和加热循环器(F-12，德国Julabo公司)，实验室pH计(PHSJ-4A，上海雷磁分析仪器厂)，实验所用光源为荧光光谱仪的氙灯。

取20 μL浓度为5×10^-4 mol/L的HRP蛋白分别加入到1.98 mL PB缓冲液和已配好的Dextran70、Ficoll70溶液中，得到浓度为5×10^-6 mol/L的HRP蛋白溶液，将蛋白样品置于10 mm石英比色池中，密封并持续通入N₂，用荧光光谱仪中的氙灯进行光照，然后进行光谱测定。

UV-Vis光谱测定：狭缝宽度2 nm，扫描波长范围220~700 nm，扫描速度200 nm/min，响应时间为中等，累计扫描3次。

荧光光谱测定：将拥挤试剂Dextran70和Ficoll70放入10 mm石英比色池中进行荧光光谱 测定，测定条件为：激发波长280 nm，激发和发射狭缝宽度均为5 nm，扫描速度为500 nm/min，响应时间为0.5 s，检测器灵敏度为中等，累计扫描3次。

同步荧光光谱测定：以Δλ=20 nm和Δλ=60 nm测定处理后样品的同步荧光光谱。激发和发 射狭缝均为5 nm，扫描速度为500 nm/min，响应时间为0.5 s，检测器灵敏度为中等，累计扫描3次。

圆二色光谱测定：狭缝宽度1 nm，扫描波长范围190~250 nm，扫描速度50 nm/min，响应时间1 s，累计扫描3次。

在稀溶液中，辣根过氧化物酶在403 nm处的吸光度为0.43，在拥挤试剂Dextran70与Ficoll70中，HRP在403 nm处的吸光度分别为0.48和0.49，与稀溶液中的HRP蛋白在403 nm处的紫外吸收强度相比，拥挤试剂中的HRP蛋白在403 nm处的紫外吸收强度要强。这是由于拥挤试剂对血红素周围的环境有一定的影响，血红素在拥挤试剂中暴露较多，使得吸光度较强。HRP的紫外-可见吸收光谱见图1。

图 1

Fig. 1

图1 HRP的紫外-可见吸收光谱 The UV-Vis absorption spectra of HRP

色氨酸残基和酪氨酸残基是蛋白质荧光的主要贡献因素^[21]。利用同步荧光光谱可得到酪氨酸和色氨酸残基的特征峰。当选择Δλ=20 nm时显示的是酪氨酸残基的荧光峰，当选择Δλ=60 nm时表现的则是色氨酸残基的荧光峰，并且色氨酸残基的荧光强度和位置对其周围的环境是敏感的^[22]。色氨酸残基的最大发射波长红移，表明其所处环境极性增加，疏水性降低，蛋白疏水结构瓦解，肽链伸展程度有所增加；蓝移则表明疏水性增加，分子趋于折叠状态^[23]。我们可以根据这些现象来判断蛋白质的构象变化^[21]。

在稀溶液中，Δλ=20 nm时(图2A)，HRP的酪氨酸残基的荧光峰在305 nm处，Δλ=60 nm(图2B)时，HRP的色氨酸残基的荧光峰在344 nm处。由于拥挤试剂自身能够吸收一定波长的光而发射出荧光(图3)，所以在稀溶液中加入拥挤试剂时，使得HRP蛋白溶液的荧光强度急剧增强，酪氨酸和色氨酸残基的荧光峰被掩盖。与相同浓度的Dextran70相比，Ficoll70的荧光强度更强(图3C)。

图 2

Fig. 2

图2 不同溶液中HRP的同步荧光光谱 Synchronous fluorescence spectra of HRP under different solutions (A)Δλ=20 nm,(B)Δλ=60 nm

图 3

Fig. 3

图3 大分子拥挤试剂Dextran70和Ficoll70的同步荧光光谱(A)Δλ=20 nm; (B)Δλ=60 nm; (C)荧光光谱 Fluorescence spectra and synchronous fluorescence spectra of macromolecular crowding reagents

辣根过氧化物酶在稀溶液与大分子拥挤试剂中采用403 nm单色光照射前后Soret带吸收峰面积变化情况如图4。从图可以看出，403 nm光照 射时，HRP在PB溶液及Dextran70溶液中可以发生光还原反应，而在Ficoll70溶液中没有发生光还原反应。在PB溶液中HRP蛋白随着光照时间的增长被光还原的量增多，而在Dextran70溶液中，光照0.5 h之内HRP蛋白被还原的量较多，随着光照时间的增长HRP蛋白被还原的量有所减少。辣根过氧化物酶在稀溶液与大分子拥挤试剂中，分别采用280 nm单色光照射前后其Soret带吸收峰面积变化情况如图5。从图中可以看出，HRP蛋白在拥挤试剂Dextran70和Ficoll70溶液中有利于光还原反应的发生，并且相同光照时间内，在Ficoll70溶液中HRP蛋白被光还原的量更多。HRP的光还原机理为光诱导的蛋白分子内电子转移，在拥挤条件下HRP蛋白光还原反应易于发生的主要原因是：拥挤试剂Dextran70和Ficoll70自身均能发射荧光，在Dextran70和Ficoll70溶液中HRP蛋白的光还原程度不同，也体现了这两种拥挤试剂光吸收和荧光发射的差异。这种差异是由拥挤试剂结构的不同造成的，Dextran70的持续长度约为0.4 nm，是一种无交联线性的、相对灵活的大分子聚合物，而Ficoll70具有高度交联的结构，是一种刚性共聚体。因此，当Dextran70与Ficoll70浓度相同时，Dextran70可以在溶液中形成准随机螺旋，从而容纳更多的间隙空间，排阻体积效应变小，吸收光能力变弱，使得其荧光发射强度较小，不利于HRP蛋白分子内电荷转移现象的发生。

图 4

Fig. 4

图4 24 ℃，403 nm光照射不同溶液中HRP其Soret带吸收峰面积的变化 The change of HRP absorption peak area at Soret band by irradiation with 403 nm at 24 ℃ under different solutions

图 5

Fig. 5

图5 24 ℃，280 nm光照射不同溶液中HRP其Soret带吸收峰面积的变化 The change of HRP absorption peak area at Soret band by irradiation with 280 nm at 24 ℃ under different solutions

不同波长的光能量是不同的，对HRP的光还原情况不同，因此我们考察了拥挤条件下不同定波长光照射HRP溶液的光还原情况，图6A为在拥挤试剂Dextran70溶液中，分别用272、280、403和498 nm波长的光照射HRP蛋白样品后，其Soret带吸收峰面积随光照时间的变化。发现272和498 nm两种波长的光不能使HRP蛋白发生光还原反应。而280和403 nm两种波长的光照射HRP蛋白溶液可以使其发生光还原反应。图6B为在拥挤试剂Ficoll70溶液中，分别用280、403和498 nm波长的光照射HRP蛋白样品后，其Soret带吸收峰面积随光照时间的变化。发现只有280 nm波长的光照射蛋白溶液时能使HRP发生光还原反应。造成这种现象的原因是拥挤试剂Ficoll70在280 nm处有紫外吸收，采用280 nm波长的光照射HRP蛋白溶液，可以激发拥挤试剂Ficoll70发射荧光，从而诱导HRP发生还原。

图 6

Fig. 6

图6 拥挤条件下不同定波长光照射HRP溶液后其Soret带吸收峰面积的变化 The peak area change of HRP at Soret band after irradiation under different fixed irradiation wavelength in crowded conditions(A) Dextran70,(B) Ficoll70

温度的改变可引起HRP蛋白构象发生变化，而HRP蛋白构象的变化会影响其酶活性。为此我们考察了不同温度(4 ℃、24 ℃、44 ℃)对大分子拥挤环境中HRP光还原的影响。

在拥挤试剂Dextran70中(图7A)，HRP蛋白溶液在4 ℃、24 ℃、44 ℃三种温度下采用403 nm单色光照射0.5 h后，其Soret带吸收峰面积减小都比较明显。在温度为24 ℃时，随着光照时间的增长，Soret带峰吸收峰面积趋于平缓，在温度为4 ℃和44 ℃时，随着光照时间的增长，Soret带吸 收峰面积越来越小，且4 ℃时Soret带峰面积减少更明显，说明在Dextran70大分子拥挤环境中，403 nm单色光照、 4 ℃时最有利于HRP光还原反应的发生。在拥挤试剂Ficoll70中(图7B)，HRP蛋白溶液在4 ℃、24 ℃、44 ℃三种温度下采用280 nm单色光照射，随着光照时间的增加，其Soret带吸收峰面积逐渐减少，在24 ℃，Soret带吸收峰面积减少程度最明显，说明在拥挤试剂Ficoll70中，280 nm单色光照、24 ℃时，最有利于HRP光还原反应的进行。

图 7

Fig. 7

图7 不同温度下光照HRP其Soret带吸收峰面积随时间的变化 The change of HRP absorption peak area at Soret band after irradiation under different temperature (A)Dextran70-HRP,(B)Ficoll70-HRP

图8为不同浓度大分子拥挤试剂中HRP光还原的情况。大分子拥挤试剂Dextran70浓度为100 g/L时，光照后HRP蛋白在Soret带吸收峰面积减少的最多，浓度为400 g/L时Soret带吸收 峰面积反而增加。说明Dextran70浓度为100 g/L 时光照还原HRP的能力最强。可能是Dextran70在较高浓度时使得HRP蛋白的血红素暴露增多，Soret带的吸收峰面积增大，且当Dextran70浓度达到200 g/L时会发生浓度荧光猝灭，其荧光发射强度降低，引起HRP光还原程度降低。在大分子拥挤试剂Ficoll70中，光照后HRP蛋白在Soret带吸收峰面积随着Ficoll70浓度的增大而逐渐减小，Ficoll70浓度为400 g/L时吸收峰面积减少的最多，即浓度为400 g/L时HRP的光还原能力最强。Ficoll70浓度增加其荧光发射强度则会逐渐增强，从而使HRP的光还原程度增大。

图 8

Fig. 8

图8 光照后不同浓度大分子拥挤试剂中HRP Soret带吸收峰面积的变化 The peak area change of HRP at Soret band after irradiation under different concentration of macromolecular crowded solutions

某些反应引起的蛋白分子二级结构变化可以通过CD光谱进行检测，因此，我们选用远紫外区CD光谱对拥挤环境中光诱导HRP还原所引起的 蛋白二级结构的变化进行检测，进一步了解拥挤 环境中光诱导HRP蛋白的还原过程。不同光照时间HRP的远紫外CD光谱如图9。由图可知，稀溶液和拥挤试剂中的辣根过氧化物酶在208 nm和222 nm均表现出两个负峰，反映的是α-螺旋结构蛋白的特征谱带，随着光照时间的增加 (0.5 h、1 h、2 h、3 h)HRP在稀溶液与拥挤试剂中208 nm和222 nm的两个负峰未发生变化，说明光照时间内蛋白未变性，光照后蛋白的二级结构未发生改变。

图 9

Fig. 9

图9 不同溶液中HRP光照后的CD光谱 CD spectra of HRP under different solutions (A)PB-HRP,(B)Dextran70-HRP,(C)Ficoll70-HRP

本文通过光谱法，对光诱导大分子拥挤环境中辣根过氧化物酶的还原过程进行了研究，结果表明大分子拥挤试剂对光还原HRP的电子传递过程及效率有影响。当采用403 nm单色光照射HRP蛋白溶液时，HRP在拥挤试剂葡聚糖70(Dextran70)中还原程度较好，而在聚蔗糖70(Ficoll70)拥挤环境下HRP不发生光还原反应；采用280 nm单色光照射时，在大分子拥挤试剂葡聚糖70(Dextran70)和聚蔗糖70(Ficoll70)环境中，HRP光还原反应得到促进，且大分子Ficoll70溶液对HRP光还原反应的促进作用更加明显；光诱导HRP还原的最适温度在Dextran70和Ficoll70溶液中分别为4 ℃和24 ℃，定波长280 nm光照射利于HRP还原；HRP在Dextran70溶液中的最适光还原浓度是100 g/L，在 Ficoll70环境中HRP还原程度随着Ficoll70浓度的增加增大；通过CD光谱可知光照射拥挤环境中HRP被还原后，其二级结构基本没有变化。