荧光猝灭法溶氧传感器具有检测精度高、抗干扰能力强、使用方便等优点,可实现溶解氧的实时监测,已日益得到人们的重视[1]。荧光溶氧传感器的关键元件是氧敏感荧光膜，它由荧光指示剂和固定指示剂的基材构成。常用的荧光指示剂是水溶性的钌(Ⅱ)二亚胺类络合物，它具有光化学稳定性好、可见光吸收系数大、荧光量子效率高、Stokes位移大和荧光寿命长等特点[2]。开发的过渡金属荧光指示剂还有铂、铱络合物等，但其吸收光谱峰值波长位于400nm附近，容易被激发光“漂白”，实际应用有限。传统的荧光溶氧传感器大多是通过物理方法将荧光指示剂固定在特定的基材。
Brian等[3]采用溶胶-凝胶法将氯化三(2,2′-联吡啶)钌(Ⅱ)配合物[Ru(bpy)3]Cl2分散在多孔硅凝胶中形成氧传感器；Demas等[4, 5]将三(4,7-二苯基-邻菲咯啉)高氯酸钌(Ⅱ) [Ru(dpp)3] (ClO4)2包埋于RTV硅橡胶内形成氧敏感荧光膜。物理吸附的荧光指示剂在荧光膜受水体浸泡时容易流失，荧光膜使用寿命短。物理包埋可减缓荧光指示剂流失，但降低荧光膜的响应速度。为解决荧光膜指示剂流失和响应速度的问题，吕太平等[6]将疏水的烷基引入三(4,7-二苯基-邻菲咯啉)钌(Ⅱ)荧光指示剂，以降低指示剂的水溶性和延长荧光膜的寿命。Wu等[7]将硅氧烷引入Ru[(dpp)2-bpy]Cl2，合成反应性荧光指示剂，并通过硅氧烷基团的水解和缩合将指示剂键合到介孔硅材料MCM-41上，保障荧光膜的响应速度和使用寿命。朱为宏等合成含卟啉和二亚胺侧基的聚甲基丙烯酰胺以化学键合铂-卟啉和铱-二亚胺荧光指示剂[8, 9]。
本文以5-氨基-邻菲咯啉为原料合成了带氨基的反应性荧光指示剂[Ru(dpp)2(phen-NH2)] Cl2，并将指示剂键合到有机玻璃表面，研究荧光膜的荧光特性和稳定性。
1 实验部分 1.1 原料与试剂4,7-二苯基-1,10-邻菲咯啉、5-氨基-邻菲咯啉、三氯化钌水合物(钌含量大于39%)为分析纯试剂，由郑州阿尔法化工有限公司提供；盐酸羟铵盐(分析纯)，天津市化学试剂一厂产品；有机玻璃片PMMA(工业级)，由广州瑞霖陈列道具提供；盐酸(分析纯)，氢氧化钠(分析纯)，无水乙醇(分析纯)，丙酮(分析纯)。
1.2 反应性钌(Ⅱ)荧光指示剂[Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2的合成 1.2.1 二(4,7-二苯基-邻菲咯啉)二氯化钌Ru(dpp)2Cl2的合成将113 mg (0.5 mmol)RuCl3·3H2O与333 mg(1 mmol)4,7-二苯基-1,10-邻菲咯啉溶于10 mL无水乙醇。将溶液转移至25 mL三口烧瓶，油浴加热至70 ℃，滴加1 mol/L的盐酸羟铵盐乙醇溶液1 mL，磁力搅拌回流反应24 h。真空旋蒸除去溶剂，加30 mL丙酮溶解，放入冰箱冷冻过夜结晶。抽滤冷冻液，以冰水、冷的丙酮各洗涤3次，真空干燥得紫黑色固体，产率71%。
1.2.2 Ru(dpp)2Cl2与5-氨基-邻菲咯啉络合将5-氨基-邻菲咯啉(phen-NH2)和合成的Ru(dpp)2Cl2溶于10 mL无水乙醇, 将溶液转移至25 mL三口烧瓶，油浴加热至70 ℃，滴加1 mol/L的盐酸羟铵盐乙醇溶液1 mL，磁力搅拌回流反应16 h。将所得产物旋蒸干燥后，以体积比4∶1的丙酮∶乙醇溶液溶解，放入冰箱过夜结晶，过滤后以冰水、冷的丙酮各洗涤3次，真空干燥得红棕色晶体，熔点为255 ℃，收率68%。
1.3 [Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2与有机玻璃表面化学键合将经800目砂纸打磨的1.5 mm厚的PMMA依次用10%的NaOH溶液和10%的盐酸溶液浸泡20 min，以乙醇、去离子水洗涤3次，在50 ℃烘箱烘干。将水解后的PMMA在荧光指示剂的等体积乙醇-水混合溶剂的溶液中，于60 ℃反应一定时间，测量染色PMMA的荧光强度。
1.4 测试与表征将合成的样品纯化后与KBr一起研磨压片，采用德国Bruker Vector-22 FTIR测试样品的红外吸收光谱，扫描范围为400～4000 cm-1，扫描次数32次。采用德国Bruker ADVANCE Digital 300核磁共振仪分析样品的1HNMR和13CNMR谱，以氘代甲醇为溶剂，DMSO为参照。采用德国Bruker maXis impact超高分辨飞行时间质谱仪测试样品的质谱，样品为10-4mol/L的甲醇溶液，电压为2000 V，扫描范围为600～1300 m/z。采用日立U-3010型紫外-可见分光光度计测试样品的UV-Vis吸收光谱，样品为10-4 mol/L的乙醇溶液，扫描范围为200～600 nm，扫描速度为 200 nm/min。荧光发射光谱在日本 Hitachi F-4600型荧光光谱仪上进行,粉末样品采用10-4 mol/L的乙醇溶液，染色PMMA片采用45°入射角，激发光波长为465 nm，激发和发射单元夹缝均为5.0 nm，光电管负高压为500 V，发射起始波长和终止波长分别为500 nm 和700 nm，响应时间为0.5 s，扫描速度为240 nm/min。采用上海棱光F93荧光分光光度计测量染色PMMA的荧光强度，激发光波长为465 nm，入射角为45°。采用新会康宇测控仪器仪表KYO-01溶氧测量仪测定PMMA表面键合荧光指示剂对溶解氧的响应特性[10]。将染色PMMA荧光帽装于KYO-01溶氧仪传感器。以460 nm LED蓝光激发荧光指示剂发射荧光，经610 nm滤光片后以光电管将荧光转换为电信号。记录染色PMMA荧光帽从氮气饱和水到氧气饱和水时溶氧仪输出值随时间的变化，扣除测量仪的背景输出，即得染色荧光帽对溶解氧的响应特性曲线。
2 结果与讨论 2.1 合成的荧光指示剂[Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2的FTIR、NMR和MS将合成产物提纯后与KBr研磨压片，在400～4000 cm-1进行红外光谱分析，所得结果如图1所示。FTIR谱图在3330 cm-1和3194 cm-1附近有伯胺的N—H伸缩振动吸收偶合双峰[11, 12]，在1591 cm-1附近有N—H弯曲振动吸收，在1360 cm-1 附近有C—N伸缩振动吸收。表明合成产物含有伯胺基。
 | 图1 合成的[Ru(dpp)2 (phen-NH2)]Cl2红外光谱图 FT-IR spectrum of synthesized [Ru(dpp)2 (phen-NH2)]Cl2 |
图2为合成目标产物的结构式，式中标示的数字为处于不同化学环境的碳原子。以ADVANCE Digital 300 MHz NMR分析合成产物的碳、氢核磁共振谱。1HNMR: 9.22(d, 1H), 9.12(m, 1H), 8.8(d, 2H), 8.65(m, 1H), 8.32(m, 4H), 8.24(s, 8H), 7.93(m,4H), 7.59(m,16H), 7.53(2H,m), 3.52(m, 2H)[10]；13CNMR:152.100(C-1), 152.089(C-10), 150.2(C-1′), 149.503(C-5), 148.585(C-3′), 148.582(C-5′), 139.087(C-6′), 135.718(C-11), 129.654(C-12), 129.547(C-3), 129.497(C-8), 129.052(C-8′), 129.0(C-6), 128.918(C-4), 128.9(C-7), 126.4(C-4′), 126.1(C-7′), 125.7(C-2),125 (C-9),124.3(C-2′)，与目标产物结构相符。
 | 图2 [Ru(dpp)2 (phen-NH2)]Cl2的结构式 Molecular formula of [Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2 |
图3为合成产物的ESI质谱结果。如图3所示，[M-H]-1的m/z为1032.2，符合[Ru(dpp)2-(phen-NH2)]Cl2的分子量。FTIR、NMR和MS结果表明合成产物为设计的荧光指示剂[Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2。
 | 图3 合成[Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2的质谱图 Mass spectrum of synthesized [Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2 |
将合成的荧光指示剂[Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2溶解于无水乙醇中，配成浓度为10-4mol/L的溶液，测量溶液的紫外-可见吸收光谱，所得结果如图4A所示。合成产物在290 nm和460 nm有两个吸收峰。290 nm处的吸收应为共轭大π键的π→π*跃迁吸收[13]，吸收强度高而分布窄；460 nm附近的吸收主要为金属到配体电荷转移跃迁吸收，吸收强度相对较弱而分布较宽[14]。然后以465 nm辐射为激发光源，测定其荧光发射光谱，所得结果如图4B-a所示。荧光指示剂荧光发射的峰值波长为570 nm，其Stokes位移达110 nm。与结构类似的荧光指示剂三(4,7-二苯基-1,10-邻菲咯啉)二氯化钌(Ⅱ)[Ru(dpp)3]Cl2的荧光发射相比，其峰值波长蓝移了约40 nm，反映在一个邻菲咯啉配体上引入一个氨基和减少两个苯基，体系的共轭程度下降，电子云密度增加，导致配合物的能级差发生变化，提升了发光能量[15]。图4B-b是荧光指示剂键合到PMMA后的荧光发射光谱。发射光谱峰值波长在590 nm,相比图4B-a中的荧光发射峰值波长570 nm，红移了约20 nm。可能化学键合后，受激荧光指示剂与有机玻璃基材更容易发生能量交换，激发能部分转移，导致发射波长红移[16]。
 | 图4 合成荧光指示剂的(A)紫外-可见吸收光谱和(B)荧光发射光谱：a在乙醇溶液中，b为键合PMMA后 (A)UV-Vis absorption spectrum of Ru(dpp)2(phen-NH2)］Cl2 and (B)Emission spectra of [Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2 ： (a)in diluted solution，(b)chemically bonded to PMMA |
将水解前后和经合成荧光指示剂溶液浸泡的PMMA表面进行全反射红外光谱分析，扣除背景噪音，所得结果如图5所示。图中曲线b为水解前PMMA，曲线a为水解后PMMA，曲线c为染色PMMA。水解前PMMA在1721 cm-1附近有酯羰基的振动吸收带，2941 cm-1附近有甲基C—H伸缩振动吸收带。PMMA经水解后在3001 cm-1处出现弱的羟基伸缩振动吸收带，而1721 cm-1处羰基伸缩振动吸收明显增强，说明PMMA经水解酸化后形成了羧酸。经合成的荧光指示剂溶液浸泡后，染色PMMA在1724 cm-1附近出现酰胺基I谱带羰基的伸缩振动吸收带，1568 cm-1处出现弱的N—H弯曲振动吸收的酰胺基Ⅱ谱带，2986 cm-1处出现N—H伸缩振动吸收带，1057cm-1处有C—N伸缩振动吸收带[17]。FTIR结果表明PMMA经合成的荧光指示剂溶液浸泡后，[Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2已通过氨基与羧基的反应，键合到PMMA表面。
 | 图5 有机玻璃红外谱图 (a)水解后PMMA；(b)水解前PMMA；(c)染色PMMA FT-IR spectra of PMMA (a) after hydrolysis, (b) before hydrolysis, (c) immersed in[Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2 solution |
将水解PMMA浸入合成荧光指示剂的醇-水溶液，在温度为50 ℃、60 ℃和70 ℃下进行化学键合反应。在反应温度为50 ℃时，酰胺化反应速度很慢，浸泡3 h后PMMA表面与反应前一样，没有着色和显著的荧光现象。而70 ℃时反应温度过高，PMMA浸泡0.5 h后虽然有着色，但出现开裂现象。PMMA的酰胺化反应温度以60 ℃为宜。
图6是化学键合反应时间对染色PMMA表面荧光强度的影响。反应温度为60 ℃，溶剂为乙醇-水等量混合，荧光指示剂浓度为0.4%。随着反应时间延长，PMMA荧光强度随之增大，反应80 min后荧光强度增加放缓，反应100 min后荧光强度趋于平坦。反应刚开始时PMMA表面羧基较多，键合上PMMA的荧光指示剂的速度快，导致PMMA荧光强度快速上升；反应一段时间后，PMMA表面羧基数量减少，键合上PMMA的荧光指示剂的速度也减慢，导致PMMA的荧光强度增加缓慢，最后趋于平衡。
 | 图6 反应时间对染色有机玻璃荧光强度的影响 Effect of reaction time on fluorescence intensity of [Ru(dpp)2 (phen-NH2)]Cl2-PMMA |
图7是荧光指示剂浓度对染色PMMA荧光强度的影响。反应温度为60 ℃，溶剂为乙醇-水等量混合，反应时间为1 h。荧光强度随荧光指示剂浓度增加而增大，但浓度增大到0.6%时荧光强度反而下降。在给定反应时间内，最初随荧光指示剂浓度增加，酰胺化反应加快，键合上PMMA的荧光指示剂增多，荧光强度上升快；但指示剂浓度增加到一定程度后，PMMA表面固定的荧光指示剂较多，进一步增加指示剂溶液的浓度，PMMA表面键合的指示剂浓度可能过高，指示剂分子间可发生能量转移，发生自猝灭现象[18]，从而导致荧光强度下降。
 | 图7 荧光指示剂浓度对染色有机玻璃荧光强度的影响 Effect of phosphor concentration on fluorescence intensity of [Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2-PMMA |
配制氮气饱和水和氧气饱和水，并将染色PMMA荧光帽装入溶氧测定仪，从氮气饱和水转换到氧气饱和水环境，测量染色PMMA荧光输出值平衡时间，结果示于图8。如图8所示，染色PMMA从氮气饱和水转换到氧气饱和水的荧光输出值平衡时间约为10 s，染色PMMA对溶解氧的响应速度快。扣除溶氧仪背景输出后，染色PMMA在氮气饱和水中的荧光输出值为4 mV，在氧气饱和水中荧光输出值为1 mV，氧猝灭比为4。由于荧光指示剂与PMMA是表面化学键合，荧光指示剂暴露在PMMA表面，与水体直接接触，从而响应时间短。但荧光输出值相对MQ树脂载负指示剂荧光帽的大幅降低[10]。一方面可能PMMA表面键合的荧光指示剂少，另一方面化学键合指示剂的荧光辐射峰值波长在590 nm，与KYO-01溶氧仪的滤光片匹配差。从实用角度考虑，需根据键合荧光指示剂的荧光特性，重新设计溶氧仪的光学系统和放大电路。
 | 图8 染色PMMA从氮气饱和水到氧气饱和水荧光输出平衡时间 Fluorescence balance time of [Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2-PMMA from nitrogen saturated water into oxygen saturation water |
将染色PMMA浸泡于去离子水中，再置于50 ℃烘箱中，测量荧光强度随浸泡时间的变化。每隔一定时间后测量染色PMMA的荧光强度5次，取平均值，所得结果示于图9。如图9所示，染色PMMA在50 ℃水中浸泡7个月，荧光强度下降小于1.0%。说明染色PMMA表面荧光指示剂相当稳定。因为合成的荧光指示剂[Ru(dpp)2-(phen-NH2)]Cl2是通过氨基与PMMA表面的羧基键合到PMMA表面。酰胺键在水中不会轻易水解分解。因此，PMMA表面键合的[Ru(dpp)2-(phen-NH2)] Cl2在50 ℃水中极少流失，荧光强度几乎没有变化。[Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2与水解PMMA的化学键合能有效解决PMMA氧敏感膜在水中荧光指示剂流失的问题。
 | 图9 键合有机玻璃后荧光指示剂的稳定性 The stability of the phosphors after bonding PMMA |
采用5-氨基-邻菲咯啉与二(4,7-二苯基-邻菲咯啉)二氯化钌(Ⅱ)络合可生成反应性荧光指示剂 [Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2。将水解PMMA浸入[Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2荧光指示剂的醇-水溶液中，[Ru(dpp)2(phen-NH2)]Cl2可通过酰胺化反应键合到水解PMMA表面，键合温度以60 ℃为佳。溶液浓度为0.5%、反应1.5 h时，键合荧光指示剂的PMMA荧光发射最强。键合的荧光指示剂对溶解氧的响应速度快，氧猝灭比为4，稳定性好。在50 ℃水中浸泡90天，荧光强度下降小于1%。
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