数字全息术已被确立为一种强大的显微成像技术与测量工具^[1]，该技术具有许多独特的优点：可同时获得样品的强度和位相信息、实现准实时三维定量成像、灵活的数字聚焦、位相畸变补偿、消噪、图像融合、多视角显示等，特别适合于生物细胞^{[2,3,4,5,6,7]}、微纳制造^[8,9,10]、材料科学^[11,12,13]、粒子场^{[14,15,16,17]}等成像与测量。

数字全息显微技术(DHM)分为两步：全息图的记录和数值再现。最常用的记录光路是预放大全息记录光路，过程如下：待测样品经显微物镜(MO)放大后形成的物光波与参考光波相干涉而形成全息图，然后由光电传感器件CCD记录后送往计算机进行物光场重建，在MO的像平面获得物体清晰的强度和位相像。记录器件CCD可位于像平面之前，也可位于像平面之后，前者称为像前预放大数字全息显微术(F-DHM)，后者称为像后预放大数字全息术(B-DHM)。这两种光路在实际中都有应用，但对这两种记录系统成像性能进行比较的研究工作尚未发现。

图1为平面参考光像前预放大数字全息显微记录及再现的空间坐标系统示意图。图中，MO已用单透镜等效表示，其焦距为f，x₀-y₀、x_Φ-y_Φ、x-y、x_i-y_i分别表示物体、MO、全息图和再现像平面；d₀为MO成像的物距、d_Φ+d=d_i为其像距、d为全息图的记录距离；R(x,y)为离轴平面参考光波，为保证再现的三级衍射像能够彻底分离，参考光传播方向与主光轴的夹角控制在2°～3°。此外，与像前预放大成像系统不同的是，在像后预放大数字全息显微记录系统中，其CCD平面位于像平面之后距离d处。

图 1

Fig. 1

图1 平面参考光预放大数字全息显微系统坐标示意图 Coordinate schematic of axis-off DMH system recorded with planar reference wave

为了表达上的简洁，以下推导中除特别说明外，一般只给出一维形式。设待测样品的光场复振幅分布为O(x₀,y₀)，MO的孔径半径为R孔径函数为P(x_Φ,y_Φ)=circ(r/R)，根据菲涅耳衍射公式，忽略无关紧要的常数位相因子，在MO前表面的衍射物光场复振幅分布为：

MO后表面的衍射光场复振幅为：

物光继续向前传播，于CCD平面时其光场分布为：

同理，经过衍射传播参考光在CCD平面的复振幅分布为：

R(x)=R₀exp[-j2π(f_xx)](4)

式中f_x为平面参考光波在x方向的空间频率，R₀为其振幅。物光与参考光在CCD平面干涉，形成的干涉条纹强度分布为：

H(x)=|O(x)|²+R₀²+O(x)^*R(x)+R^*(x)O(x)(5)

干涉场被CCD记录、进行离散化并最终传输到计算机中进行模拟再现。由CCD记录得到的数字全息图的分布为：

式中Δx和L_x分别为CCD沿x方向的像元尺寸及光敏面尺寸，a(a≤1)为其填充因子。

为了简便起见，在以下的讨论中依然以连续光场形式进行光波场的再现。模拟再现光波的表达式与原参考光波相同，采用原参考光波R(x)照射全息图，即与全息图相乘，得到|R(x)|²O。当用原平面参考光波R(x)再现物光场时，由于平面参考光波的复振幅分布是一个线性的位相因子，降低了再现光波中记录距离d(实验测量值)对再现像精度的影响，因此无需做自动聚焦也能得到较为精准的再现像。全息图经再现光波照射后，衍射聚焦成像，忽略菲涅耳衍射公式中的常数项，化简整理后在MO像面上得到的对应于原始像的光场复振幅分布为：

其中rect(x/L_x)的作用是限制CCD记录的光场范围。由式(7)可以得到再现光场的强度分布及含有二次及一次位相畸变的包裹位相分布，通过适当的位相畸变补偿及解包裹运算即可获得物体的连续位相分布。

上述重建过程通常利用快速傅里叶变换实现数值重建。根据线性系统理论及傅里叶变换定理，得到式(7)的傅里叶变换表达式：

式中FT^-1表示逆傅里叶变换。

对于像后预放大数字全息显微系统来说，CCD平面位于MO的像平面之后距离d处，再现时需要光波场逆向传播至该像平面。因此，只需将像前预放大数字全息系统中的关系d_i=d_Φ+d改为d_i=d_Φ-d，同时将式(8)中的d改为-d,将FT^-1改为傅里叶变换FT即可。

根据瑞利判据，光学系统的成像分辨率由系统点扩散函数的主瓣半宽决定，由此,我们先来分析像前预放大数字全息显微成像系统的点扩散函数。

暂且忽略CCD像元的抽样作用，仅考虑MO和CCD的有限孔径。设物函数是由位于物平面上ξ处点源发出的单位振幅球面光波，则物光场O(x₀)=δ(x₀-ξ)，将此式带入式(1)，并联立式(2)~(8)，经过复杂的数学运算^[18]，可得到上述平面参考光记录的像前预放大数字全息系统的点扩散函数如下：

式中M=-d_i/d₀为再现像的放大倍数,A为常数因子，符号*表示卷积运算。式(9)中的第一个sinc函数在二维情况下变为一阶贝塞尔函数，即J₁(2πRρ)/Rρ,其中ρ为空间频率坐标，在二维情况下其取值为：

同理可推得像后预放大数字全息显微系统的点扩散函数如下：

由式(9)和式(11)，预放大数字全息显微系统的点扩散函数等于MO成像的点扩散函数和CCD单元成像的点扩散函数的卷积，卷积具有扩展作用,不过，对于显微成像来说，卷积的扩展作用是很小的^[19]。因此该系统的分辨率将受到MO和CCD成像分辨率的影响，并取决于两者中分辨率较低者。J₁(2πRρ)/Rρ的主瓣半宽取决于MO的数值孔径，表征了MO的成像分辨率，其值为δ=0.61λ/NA,NA表示显微物镜的数值孔径；而sinc[N_xΔx(x_i+Mξ)/λd]的主瓣半宽表征着记录CCD单元成像的分辨率高低，它随着全息图记录距离的增大、CCD光敏面尺寸的减小而降低。此外，由式(6)可知，还存在CCD像元的平均效应而导致的分辨率降低现象。由于像前及像后预放大数字全息显微系统的成像分辨率均随着全息图记录距离的减小而提高，因此，记录距离d=0是其极端情况，也是像前与像后预放大的临界情况，该情况下的成像分辨率最高^[20]。

虽然像前及像后预放大数字全息显微成像系统具有相似的成像规律和成像分辨率，但从信息记录的角度来看，若用同样的CCD记录器件，像前预放大数字全息所记录的物体区域和最高空间频率大于像后预放大数字全息系统，因此，像后预放大DHM一般不可取。

为了验证上述理论分析的正确性，构建了如图2所示的平面参考光预放大数字全息显微记录光路。由He-Ne激光器发出的波长为632.8 nm的激光经偏振分束棱镜PBS后分为两束，并分别经扩束-滤波-准直系统后，一束形成照明样品的平面光波，并经显微物镜MO后形成放大的物光波， 另一束平面参考光波，两束光经棱镜BS合束后发 生干涉，并被位于样品像平面前或后的CCD传感器所记录，随后送往计算机进行处理。实验所 采用的CCD像元大小4.65 μm×4.65 μm、像素数1392×1032、16 bit灰度级输出；MO放大倍率为 40×，数值孔径为0.65，焦距分别为4.65 mm，其理论极限分辨率是0.59 μm。

图 2

Fig. 2

图2 平面参考光数字全息显微记录光路系统示意图 Schematic of the setup of axis-off DHM recorded with plane reference wave

图3(a)是利用图2所示系统记录的像前预放大数字全息图，其大小为1024×1024，全息图记录距离是46 mm。将图3(a)进行裁剪，得到大小分别为512×512、256×256的全息图，如图3(d)、图3(g)所示。图中第二列和第三列分别是相应的全息图的频谱图和强度再现像。由图3(c)可以看出，利用该像前预放大数字全息显微系统可以清晰地分辨图像测试板的第9.3组线条(其线宽为0.78 μm)。比较图3(c)、(f)、(i)可以看出，在CCD像元大小不变的情况下，随着CCD光敏面尺寸的减小，像前预放大数字全息显微系统的成像分辨率降低，尤其是图像边缘部分，这是由于该系统对样品边缘部分高频信息记录不完整的缘故^[21]。需要指出的是，该系统的成像分辨率随着全息图记录距离的增大而降低的实验验证已经在其他文献中给出^[18]。

图 3

Fig. 3

图3 像前预放大数字全息记录的全息图(左列)、全息图频谱(中列)和由菲涅耳算法得到的强度再现像(右列) (a)、(b)、(c): 1024×1024； (d)、(e)、(f): 512×512； (g)、(h)、(i): 256×256 Holograms with different size (left columns),frequency spectra (middle columns) and intensity images recorded by F-PMDH and reconstructed by Fresnel algorithm (right columns) (a)，(b)，(c)： 1024×1024,(d)，(e)，(f)： 512×512,(g)，(h)，(i)： 256×256

图4(a)是利用同样的系统记录的像后预放大数字全息图，其大小1024×1024，全息图记录距离仍为46 mm。图4(d)、(g)分别是由图4(a)裁剪后得到的全息图，其大小分别为512×512和256×256。图中后两列分别是相应的频谱图和强度再现像。由图4(c)，该像后预放大数字全息系统仍能分辨图像测试板的第9.3组线条。比较图3(c)、(f)、(i)，同样得到了随着CCD光敏面尺寸减小成像分辨率降低的结论。然而，分别比较图3(f)与4(f)、图3(i)与4(i)，显见在同样条件下，像后预放大数字全息系统的成像分辨率和成像质量低于像前预放大数字全息系统，尤其是在CCD光敏面尺寸较小的情况下，这种差异更为明显。因此，实验结果证明了上述理论分析的正确性。

图 4

Fig. 4

图4 像后预放大数字全息记录的全息图(左列)、全息图频谱(中列)和由菲涅耳算法得到的强度再现像(右列) (a)、(b)、(c): 1024×1024； (d)、(e)、(f): 512×512； (g)、(h)、(i): 256×256 Holograms with different size (left columns),frequency spectra (middle columns) and intensity images recorded by B-PMDH and reconstructed by Fresnel algorithm (right columns) (a)，(b)，(c)： 1024×1024,(d)，(e)，(f)： 512×512,(g)，(h)，(i)： 256×256

对像前及像后预放大数字全息图的记录、再现及点扩散函数进行了分析，得到了该系统横向分辨率的影响因素，并对两种系统的成像分辨率进行了比较，理论分析得到了实验验证。结果表明：像前及像后预放大数字全息显微系统的横向分辨率均随着全息图记录距离的增大、记录器件光敏面尺寸的减小而降低；在其他条件相同的情况下，像前预放大数字全息显微系统的成像分辨率及成像质量优于像后预放大数字全息显微系统，尤其是在记录器件光敏面尺寸较小时这种差异更为明显。