2. 华东理工大学 科技信息研究所, 上海 200237
2. Institute of Science and Technology Information, East China University of Science & Technology, Shanghai 200237, P.R.China
目前，荧光探针由于其选择性好、灵敏度高、合成成本低廉等优势已经成为痕量物质检测和生命科学研究中必不可少的技术手段[1-4]。荧光能量共振转移技术 (FRET) 是指在两个距离在10 nm范围以内的荧光分子间产生的一种能量转移现象[5, 6]。近年来，作为荧光探针分子设计的主要调控机理之一，FRET在空间分辨率、距离范围和敏感性方面有很大提高，大大拓宽了其应用。利用FRET机理设计的探针可以极大地减弱由样品环境改变导致的荧光强度变化的影响。另外，在生物实验中利用FRET荧光比率测定法可有效消除光漂白、探针渗透等现象并可提升探针的灵敏度和拓宽其检测限。
罗丹明和氟化硼络合二吡咯甲川类荧光染料 (BODIPY) 由于具有独特的结构特征和优良的光学性质，被广泛用于荧光传感器的设计[7, 8]。一般罗丹明类染料在可见光区域没有吸收峰，使用400~600 nm波长激发，不发射荧光，但当其独特的五元环内酰胺结构 (闭环结构) 与外加的离子或者小分子发生配位或反应时，罗丹明的五元环结构会被打开，整个分子的共轭结构恢复，在500~600 nm会出现一个吸收峰，同时受光的激发，其荧光峰可以达到甚至超过600 nm[9]。选择BODIPY染料为能量给体，是因为其本身的荧光强度不易被外界环境干扰，而且通过修饰的BODIPY染料，其荧光发射峰完全可以超过500 nm，与罗丹明单体的吸收波长有比较好的重叠[10]。基于此原理，可以设计出一种基于BODIPY和罗丹明单元之间的FRET过程的探针。
作为生物标志物，α-酮戊二酸 (α-KA) 是近年来的研究热点之一。越来越多的研究表明，人体内α-KA水平与很多疾病密切相关，如非酒精性脂肪肝、急性髓细胞白血病等[11-14]，故实现小分子α-KA的检测对很多疾病的预防和诊断都有着非常重要的临床意义。针对传统测试条件的不足[15-17]，本文合成了基于FRET机理的含有罗丹明和BODIPY单元的荧光传感器RDM-BO (图 1)。其识别机理是：RDM-BO本身的罗丹明单元是闭环的结构，没有荧光，但罗丹明单元中的肼基可以与α-KA的活性羰基发生反应生成Schiff碱，其结构中的酞胺螺环的吸电子能力增强，诱导开环，整个分子的共轭结构发生改变，产生新的荧光[18-22]。其原理是由于BODIPY单元与开环后的罗丹明单元存在FRET过程，会产生能量转移，所以使用较短的单波长激发就会产生长的荧光发射峰，避免了出现重叠荧光峰的干扰。
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图 1 荧光探针RDM-BO的合成 Fig.1 Synthesis of fluorescent sensor RDM-BO |
测试所用各种溶液均由高纯水配置。N, N-二甲基甲酰胺、甲苯和二卤甲烷在使用前经重蒸除水后, 加入干燥的分子筛保存。α-KA和4-羟乙基哌嗪乙磺酸采购自阿拉丁有限公司。联硼酸频那醇酯、1, 1′-双 (二-叔丁基膦基) 二茂铁二氯合钯和四 (三苯基膦) 钯分别从上海达瑞精细化学品有限公司、上海迈瑞尔化学技术有限公司和百灵威科技有限公司处购买。其他试剂除特殊说明外，均为市售分析纯或化学纯，使用前没有经过进一步提纯。缓冲溶液选用HEPES溶液，不同的pH值由4-羟乙基哌嗪乙磺酸与氢氧化钠滴定形成，pH计实时测量。探针母液由二甲基亚砜配置，浓度为5×10-6 mol·L-1，α-KA溶液由高纯水配置，浓度为1×10-3 mol·L-1。
核磁共振氢谱和碳谱 (1HNMR和13CNMR) 采用Brucker Avance 400超导傅里叶变换核磁共振波谱仪 (400 MHz)，用CDCl3和DMSO-d6作为氘代溶剂进行测定 (以TMS为内标，温度不加说明均为293 K)。高分辨质谱 (HRMS) 采用Waters LCT Premier XE质谱仪，以MeOH或CH2Cl2作为溶剂进行测试。紫外-可见光吸收光谱采用Varian Cary 100紫外-可见分光光度计进行测定。荧光发射光谱采用Varian Cary Eclipse荧光光谱仪进行测定。
1.2 探针RDM-BO的合成化合物1的合成：将干燥后的二氯甲烷100 mL加入250 mL三口烧瓶中，氩气鼓泡30 min。分别用10 mL注射器将2, 4-二甲基吡咯 (740 mg, 2.62 mmol) 和4-碘苯甲醛 (1.1 g, 4.74 mmol) 溶于15 mL干燥二氯甲烷的溶液并注入到三口烧瓶中，避光，氩气保护，磁力搅拌。将1滴三氟乙酸溶于干燥二氯甲烷中，注射器注入反应体系，观察到反应液变红。搅拌过夜，TLC点板确定反应结束。加入DDQ (1.1 g, 4.8 mmol) 的二氯甲烷溶液，继续搅拌45 min。观察到溶液颜色变黑，加入三乙胺 (9 mL) 继续搅拌15 min。冰浴条件下，加入三氟化硼乙醚络合物 (18 mL) 搅拌过夜。观察到溶液在紫外灯下呈现亮绿色荧光。反应液用水洗涤3次，饱和碳酸氢钠溶液洗涤1次，用无水硫酸镁干燥二氯甲烷相，过滤，旋蒸蒸干二氯甲烷。柱层析分离 (干法上样，流动相为石油醚：乙酸乙酯=5：1)。收集第1个组分，旋干流动相，得到红色固体510 mg，产率为25.20%。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.39(s, 6H, CH3), 2.45(s, 6H, —CH3), 6.20(s, 2H, pyrrole-H), 7.21(d, 2H, phenyl-H, J=8.0 Hz), 7.94(d, 2H, phenyl-H, J=8.0 Hz)。13CNMR (100 MHz, CDCl3): 12.62, 44.38, 65.96, 97.95, 104.50, 108.04, 123.01, 123.84, 128.11, 128.14, 130.00, 132.55, 148.89, 151.56, 153.86, 166.19。HRMS (ESI): calcd for C19H19N2F2BI[M+H]+: 451.0654, found 451.0651。
化合物2-BODIPY的合成：100 mL的三口瓶中依次加入 (200 mg，0.444 mmol) 化合物1、100 mg醋酸钾、30 mL二氧六环、300 mg联硼酸频那醇酯、40 mg 1, 1′-双 (二-叔丁基膦基) 二茂铁二氯合钯，90 ℃下搅拌反应20 h。柱层析分离，流动相为石油醚：乙酸乙酯=10：1，收集红色产物约80 mg，产率40%[23]。
1HNMR (400 MHz, CDCl3): 1.36(s, 6H, CH3), 1.39 (s, 12H, CH3), 2.55 (s, 6H, CH3), 5.97 (s, 2H, pyrrole-H), 7.29 (d, 2H, phenyl-H, J=8.0 Hz), 7.90 (d, 2H, phenyl-H, J= 8.0 Hz)。
化合物5-RDM的合成：取1 g多聚磷酸溶于40 mL干燥的DMF溶液中，搅拌30 min溶解，再加入4-溴-2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰) 苯甲酸 (化合物4, 600 mg，1.53 mmol)、间乙基氨基对甲苯酚 (300 mg，1.98 mmol)，氮气保护下搅拌回流24 h，反应完毕，冷却，加入100 mL的蒸馏水中，洗出固体抽滤，用冷水洗3次 (10 mL×3)，柱层析分离得红黑色固体100 mg，产率为12.2%[24]。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.13 (t, 12H, CH3), 3.41 (m, 8H, CH2), 6.58 (m, 6H, phenyl-H), 7.60 (s, 1H, phenyl-H), 7.93 (m, 2H, phenyl-H)。HRMS (ESI): calcd for C28H30BrN2O3[M+H]+: 521.1440, found 521.1437。
化合物6的合成：50 mL的圆底烧瓶中依次加入化合物2-BODIPY (470 mg，1.07 mmol)、化合物5-RDM (270 mg，0.58 mmol)、碳酸钠 (200 mg)、水2.5 mL、四 (三苯基膦) 钯 (3 mg)、四氢呋喃10 mL，氮气保护下，90 ℃加热回流6 h。产物柱层析分离 (DCM：MeOH=10：1) 得红色固体70 mg, 产率为15.8%。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.13 (m, 12H, N (CH2CH3)2), 1.37 (s, 6H, pyrrole-CH3), 2.45 (s, 6H, pyrrole-CH3) 3.45 (m, 8H, N (CH2CH3)2), 6.18 (s, 2H, pyrrole-H), 6.65 (m, 6H, phenyl-H), 7.46 (d, 2H, phenyl-H, J=8.0 Hz), 7.77 (s, 1H, phenyl-H), 7.98 (d, 2H, phenyl-H, J=8.0 Hz, ), 8.18 (d, 2H, phenyl-H, J=7.6 Hz)。HRMS (ESI): calcd for C47H48BN4O3F2[M+H]+: 765.3788, found 765.3790。
化合物RDM-BO的合成：在100 mL的圆底烧瓶中加入100 mg化合物6(0.13 mmol)、0.5 mL水合肼、40 mL甲醇，加热回流6 h，反应完毕，旋干甲醇，加入新配置的盐酸溶液 (5 mL浓盐酸加20 mL水) 溶解，再加入15 mL 4.7 mol·L-1氢氧化钠水溶液，搅拌后析出固体，抽滤得粗产品，柱层析分离得到产物40 mg，产率为39.5%。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): 1.09 (m, 12H, N (CH2CH3)2), 1.34 (s, 6H, pyrrole-CH3), 2.44 (s, 6H, pyrrole-CH3) 3.46 (m, 8H, N (CH2CH3)2), 3.51 (s, 2H, NH2), 6.16 (s, 2H, pyrrole-H), 6.38 (m, 6H, phenyl-H), 7.38 (m, 3H, phenyl-H), 7.76 (m, 2H, phe-nyl-H), 7.87 (m, 2H, phenyl-H)。HRMS (ESI): calcd for C47H49BN6O2F2[M+H]+: 779.4056, found 779.4053。
2 结果与讨论 2.1 探针RDM-BO的设计本课题组曾报道了基于罗丹明B的的激活型α-KA荧光探针，经过优化测试条件，测试结果达到了预期的设计，证明了罗丹明独特的五元环内酰胺结构可以与α-KA的活性羰基发生反应生成Schiff碱，吸电子能力增强，诱导罗丹明结构开环使荧光增强[25]。但测试微环境的改变容易引起样品的荧光强度的变化，影响测试效果，同时荧光增强倍数不是很高，因此，本文设计了一种基于FRET机理的比率型探针RDM-BO用以改善测试效果，其结构含有罗丹明单元和经过修饰的BODIPY单元。因为罗丹明有着独特的五元环内酰胺结构，所以既可以作为识别基团又可以作为能量受体，而经过修饰的BODIPY单元在光谱性质上匹配罗丹明结构, 并具有良好的光化学性质，可以作为能量供体 (图 2)。
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图 2 荧光探针RDM-BO检测α-KA的机理 Fig.2 Fluorescence response mechanism between RBN and α-KA |
取2 mL HEPES缓冲溶液 (pH=6.1)，分别加入40 μL的BODIPY、开环和闭环RDM单体、RDM-BO母液，母液浓度均为5×10-6 mol·L-1，检测温度为37.4 ℃，在后续测试中，保持温度和pH值不变。通过紫外-可见光吸收光谱仪检测，可以发现BODIPY单体在500 nm附近有明显的最大吸收峰，而闭环状态下的RDM单体在可见光区域没有明显的吸收，开环的RDM单体的最大吸收峰在550 nm处，探针RDM-BO初始的最大吸收峰和峰型与BODIPY单体基本一致 (图 3)。当加入50倍当量的α-KA以后，可以清楚地发现RDM-BO在550 nm处出现一个新的吸收峰，同时500 nm处的吸收发生微小的减弱。其产生的新峰的峰型位置与开环RDM单体的吸收峰接近，说明了加入α-KA以后，RDM-BO整个分子的共轭结构发生改变，产生了新的吸收峰。因此，通过紫外-可见光吸收光谱的研究可知，探针RDM-BO与α-KA发生反应后，通过RDM单元的开环和FRET过程的发生，吸收谱图有明显的变化，证明了探针识别α-KA的有效性。
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图 3 浓度为10 μmol·L-1开闭环RDM单体、BODIPY单体、探针RDM-BO和加入50倍当量α-KA后RDM-BO的紫外吸收谱图 Fig.3 Absorption spectra of 10 μmol·L-1 open or closed RDM, BODIPY, RDM-BO and RDM-BO upon with 50 eq. α-KA |
用449 nm的光激发，从图 4荧光发射光谱观察到，闭环RDM单体没有明显的荧光峰，开环的RDM单体在575 nm处有一个明显的荧光峰，BODIPY单体在其特征区域520 nm处有一个明显的荧光峰。与吸收光谱相似的是RDM-BO初始荧光光谱图跟BODIPY单体基本一致，当加入50倍当量的α-KA之后，可以明显观察到580 nm处产生了一个新的荧光发射峰，同时在520 nm处的BODIPY单元的荧光特征峰的荧光强度明显减弱。
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图 4 用449 nm的光激发，浓度为10 μmol·L-1开闭环RDM单体、BODIPY单体、探针RDM-BO和加入50倍当量α-KA后RDM-BO的荧光发射谱图 Fig.4 Fluorescence spectra of open or closed RDM, BODIPY, RDM-BO and RDM-BO upon with 50 eq.α-KA, λex=449 nm |
当α-KA加入后，探针RDM-BO吸收光谱因为RDM单元的开环，在550 nm处产生一个新的吸收峰，其对应的荧光光谱在接近600 nm处产生一个新的荧光峰，使用449 nm的光激发时，因为能量的转移，在520 nm处的BODIPY单元的荧光特征峰强度减弱。为了进一步研究FRET机理，使用522 nm的光激发，其中BODIPY单体、闭环RDM单体和未加入α-KA的探针RDM-BO没有明显的荧光峰，开环的RDM单体在575 nm处有明显的开环荧光峰。而加入50倍当量的α-KA后，在585 nm处产生新的荧光峰，而新产生的荧光峰与开环的RDM单体接近，由于探针RDM-BO的RDM单元的螺环被打开，共轭结构恢复，产生新的荧光峰 (图 5)。根据紫外-吸收和荧光发射谱图研究，其机理可以认为是探针RDM-BO结构中的RDM单元本身是闭环结构，在可见光区域没有吸收，没有荧光，随着α-KA的加入会促使RDM单元的螺环部位发生开环，使RDM单元处的共轭结构增大，产生新的吸收峰和新的荧光峰。而新产生的吸收峰与BODIPY单元的荧光峰产生重叠，从而实现BODIPY单元到RDM单元的FRET过程 (图 2)。
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图 5 用522 nm的光激发，浓度为10 μmol·L-1开闭环RDM单体、BODIPY单体、探针RDM-BO和加入50倍当量α-KA后RDM-BO的荧光发射谱图 Fig.5 Fluorescence spectra of open or closed RDM, BODIPY, RDM-BO and RDM-BO upon with 50 eq.α-KA, λex=522 nm |
如图 6所示，使用522 nm的光激发，在探针RDM-BO中分别加入1、2、3、5、10倍当量的α-KA。可以清楚地观察到，随着α-KA的不断加入，RDM-BO的吸收谱图中出现两个变化，500 nm左右处的吸收峰不断减弱，同时在560 nm处出现一个新的吸收峰并且缓缓增强，相似的是在荧光光谱中，575 nm处产生一个缓慢增加的新荧光峰，其波长也随着α-KA的不断加入慢慢红移。通过滴定曲线研究可知，随α-KA不断的加入，越来越多的RDM-BO与α-KA发生反应，RDM单元开环产生新的共轭体系，吸收发生的一系列变化表明FRET过程的实现，因此在575 nm处出现新的荧光峰且随着α-KA的加入缓慢上升。在pH为6.1的HEPES缓冲溶液中，检测温度为37.4 ℃，RDM-BO的浓度为10 μmol· L-1、α-KA的浓度为0.1 mol·L-1时，荧光强度数值从500左右增加到2100左右。RDM-BO对α-KA检测限的测定就是逐步滴加0~10当量的α-KA到浓度为10 μmol·L-1的RDM-BO的HEPES缓冲溶液中，记录其荧光强度的变化，再以α-KA浓度的对数值为横坐标，以最大波长处的荧光强度差值的比值 (I-Imin)/(Imax-Imin) 为纵坐标做图，对其线性部分进行拟合，拟合得到的直线与X轴的交点的横坐标对应的α-KA的浓度就是RDM-BO对α-KA的检测限。按上述方法经线性拟合得到RDM-BO对α-KA的检测限为3.14×10-6 mol·L-1[26]。
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图 6 加入不同当量的α-KA后探针RDM-BO (10 μmol·L-1) 的紫外吸收谱图 (A) 和荧光发射谱图 (B) Fig.6 Absorption spectra (A) and fluorescence spectra (B) of RDM-BO upon with different concentrations (eq.) of α-KA |
基于传统荧光探针FRET机理，设计合成了一种含有罗丹明和BODIPY单元的荧光探针RDM-BO，可以检测小分子生物标志物α-KA，其中BODIPY单元和罗丹明单元有着不重叠的荧光发射峰，方便进一步光谱性质研究。实验证明，只有RDM-BO与α-KA反应使罗丹明单元开环才会发生FRET过程，使用449 nm的光激发，BODIPY单元的荧光峰减弱的同时，罗丹明单元的荧光峰会出现并且增强。在pH为6.1的HEPES缓冲溶液中，检测温度为37.4 ℃、RDM-BO的浓度为10 μmol·L-1、α-KA的浓度为0.1 mol·L-1时，荧光强度数值从500左右增加到2100左右。和传统的高效液相及核磁共振检测α-KA的方法相比，使用荧光探针RDM-BO更加方便、经济、快捷，具有潜在的应用价值。
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