2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, P. R. China
烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)是烟草花叶病等的病原体，主要感染烟草及其他茄科植物，因健康的叶片被感染后呈斑驳状而得名。作为生物合成的纳米粒子，TMV与其他病毒一样，具有单分散的尺寸及分子量、明确的空间结构，其表面化学基团可以在形貌和完整性不被破坏的前提下，通过基因工程或者化学修饰的方法改性[1]，更重要的是，不同于生物安全性较低的动物病毒，TMV不会感染人及哺乳动物。因此，TMV在生物、材料等领域受到了极大关注，研究者们尝试对TMV进行一系列的化学或基因改性，使TMV在生物医用材料、光捕获体系、能量存储、传感、催化、成像等领域发挥更大的应用潜能[2-6]。
1 烟草花叶病毒的发现与基本结构TMV是人类最早发现、最早提纯和最早在电子显微镜下观测到的病毒。1883年，在荷兰工作的德国农业科学家麦尔(Adolf Mayer)发现烟草花叶病株的汁液可使健康烟草感染烟草花叶病，因而认为烟草花叶病是一种由细菌引起的植物传染病。1892年，俄国植物学家伊万诺夫斯基(D. Iwanowski)发现，选用连最小细菌都无法透过的尚柏朗过滤器过滤病株汁液，滤出的汁液仍然能使烟草感染该病，他认为是可过滤性的细菌或其分泌的毒素导致了烟草花叶病[7]。1898年，荷兰植物学家贝叶林克(Martinus Willem Beijerinck)证实了过滤液中病原体的可复制性，且这种可复制性并不像细菌一样可以在培养皿中进行，而只能在它感染的宿主中实现，他把这种比细菌更小更简单的可复制的有机体称为“传染性的活的液体”，取名为“病毒”(virus)，贝叶林克因而成为公认的第一个提出病毒概念的科学家[8]。
1935年，美国生物化学家斯坦利(Wendell Meredith Stanley)[9]发现TMV的侵染性可被胃蛋白酶破坏，因此认为TMV大部分是由蛋白质所组成，并且通过研磨、过滤、盐析等方法，第一次从受感染的植物细胞中获得了TMV的病毒晶体。随后，他将病毒成功地分离为蛋白质部分和RNA部分。斯坦利也因其对TMV的研究与另外两名科学家一起荣获1946年的诺贝尔化学奖。
1939年，TMV的形貌于由德国科学家考施(G. A. Kausche)[10]第一次在电子显微镜下观察到。至今，TMV是结构研究最为透彻的病毒之一。如图 1所示，在透射电子显微镜下，TMV呈半刚性的一维棒状结构，长300 nm，外直径18 nm，且具有直径4 nm的内空腔[1, 11, 12]。TMV的结构非常稳定，在pH 2~10间可稳定存在，可以在60℃温度下稳定存在30 min，且可以承受有机溶剂占80%体积比的有机溶剂/水混合溶剂。TMV总分子量为3.94×107 Da，由一条分子量为2×106 Da的单链(+)RNA以及蛋白外壳构成，其中蛋白外壳是由2130个相同的分子量为17530 Da的衣壳蛋白(TMVCP)围绕RNA右手螺旋状排列构成的规整蛋白组装体。在其天然形成的空间高度有序的组装体中，每一个TMVCP只暴露3个反应活性位点：位于外表面的139位酪氨酸残基(提供活性酚羟基)、位于内空腔表面的97位，以及106位谷氨酸残基(提供活性羧基)[13]。因此，通过这些基团的特殊化学反应，可以在形貌和完整性不被破坏的前提下，对TMV实现特定位点的修饰。同时，通过基因工程改性，并借助原核或真核系统的表达，也可将功能性基团或多肽引入TMV的特定位点。
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图 1 (a)透射电子显微镜下TMV的结构图(标尺：100 nm)；(b)TMV结构示意图 Fig.1 (a) Transmission electron microscope image of TMV (scale bar: 100 nm); (b) Structure for TMV |
TMV作为病原体可以侵染的寄主范围很广，已知对单子叶植物22科中的200种以上植物具有寄生性，其中“本氏烟草(Nicotianabenthamiana)”、“黄花烟草(Nicotianarustica)”等烟草属植物, 可以用于TMV的培养和提纯，1 g被感染的叶子最高可提纯4.5 mg TMV。本氏烟草生长6~8周后即可进行TMV的感染，先将少量碳粉或硅胶粉等撒在嫩叶处，然后纱布蘸取TMV溶液，以中等力度在撒有碳粉或硅胶粉的嫩叶上摩擦，嫩叶被磨出轻微伤口的同时TMV进入伤口中，进而在烟草叶片中复制繁殖。被感染的叶片收集之后立即置于-80 ℃环境中，之后通过搅碎、过滤、萃取、盐析、离心、复溶、超速离心、透析等过程，可获得较纯的TMV水溶液[13]。近年来，为避免RNA对TMV生物效应的影响，研究者们逐渐开始通过大肠杆菌表达的方法来获得类TMV纳米颗粒[14]，即将含有TMV基因的原核表达质粒转入感受态大肠杆菌，在一定的温度下，用诱导剂IPTG诱导TMV衣壳蛋白在大肠杆菌中表达。TMV衣壳蛋白表达成功后经提纯，可在一定的pH值、温度和离子强度下组装为盘状或棒状组装体。用该方法得到的类TMV纳米粒子不含遗传物质，且长度和形貌可控。
3 烟草花叶病毒的基因工程改性TMV的外壳由同一种衣壳蛋白自组装形成，因此首先对TMVCP进行改造，然后诱导其自组装，这是实现TMV改性的一种有效方法。基因突变手段提供了对TMVCP进行改造的理想方法，由于外壳蛋白的C端和N端以及两个α螺旋之间的曲面环位于组装体的外表面，因此均可以作为理想的突变区域。而内空腔则由于较长环状结构的限制，难以用于基因修饰。根据已有报道，TMV的基因工程改性大致可分为两类：一类是特定位点的突变，包括常见氨基酸的替换与插入、非常见氨基酸和非天然氨基酸的引入，如引入含有巯基的半胱氨酸(Cys，C)[15-17]、含有氨基的赖氨酸(Lys，K)[14, 18, 19]等；另一类则是插入含有2~20个氨基酸的功能性多肽，如六位组氨酸标签(His-tag)[20]、短链多肽RGD[21]等。通过基因突变的手段改变TMV的氨基酸序列，扩展其本身有限的反应官能团，有望使TMV在金属沉积[22]、光捕获能量传递[23]、蛋白疫苗[18]和纳米阵列[24]等领域发挥潜在作用。
3.1 特定位点的突变通过基因工程实现特定位点的突变，最为经典的是突变体TMV-1Cys的产生。TMV-1Cys是由2号位插入一个半胱氨酸的TMVCP自组装而来，半胱氨酸侧链的巯基官能团可以暴露于组装体的外表面与端部。暴露于组装体外表面的巯基官能团与金属粒子之间可以形成共价键，使金、银、铂等纳米颗粒[25-27]很好地包被到病毒体的外表面，大大推进了各种一维纳米线与图案化纳米材料的涌现，并且改进了早期利用TMV作为基底进行金属颗粒沉积时金属颗粒沉积不规则、可控性差等缺陷。暴露于端部的巯基官能团还可以实现TMV在金基底表面的自组装。如Royston等[28]将TMV-1Cys自组装到金基底表面，随后将钯、镍、锆等包被到病毒体的外侧，制备出三维纳米材料，随后将其应用到电池电极中。Brown等[29]利用金基底自组装的病毒体，结合酶联免疫技术，制备出用于分子检测的三维结构，用于特定生物分子的检测。
将TMV-1Cys突变体进行进一步的化学反应，可进一步扩大TMV的应用领域。Yi等[30]利用TMV-1Cys表面的巯基官能团，将荧光分子通过简单的化学反应修饰到TMV-1Cys表面，结合核酸杂交技术，使TMV-1Cys末端的核酸片段只与特定互补的序列结合，通过检测TMV-1Cys的光信号，来完成对特定序列的检测。该路线也被Miller等[31, 32]用于构建基于荧光能量共振转移的光捕获系统，利用TMV-1Cys中暴露的半胱氨酸与荧光生色团连接，再通过供体受体间的共振能量转移来提高光捕获效率。此外，一些具有相互作用的生物分子同样可以通过这种方法来进行检测。Jung等[33]通过TMV-1Cys表面的巯基先与PEG化的环状中间体进行反应，然后连接藻红蛋白抗体，借助DNA杂交将其自组装至聚乙二醇-壳聚糖水凝胶基底，可以作为检测材料，实现对藻红蛋白的检测。
通过基因工程实现特定位点的突变，除了常见氨基酸的替换与插入，非常见氨基酸和非天然氨基酸也被引入到TMV当中，进一步增加了TMV表面修饰的范围和领域[34]。刘俊秋课题组[35]利用计算机模拟发现，在TMV的表面存在类似于谷胱甘肽过氧化物酶催化活性中心的三维结构，于是通过半胱氨酸缺陷型蛋白表达系统，将硒半胱氨酸引入到相应的位点，构建起以TMV作为载体的纳米酶催化体系。本课题组与王江云课题组[36]利用密码子扩展技术，首次将含有叠氮基团的非天然氨基酸(KPN)插入到蛋白氨基酸序列中的特定位点，使TMV组装体的外表面具有了天然氨基酸所不具备的叠氮官能团(图 2)，可以直接进行click反应，并能够利用生物素-链霉亲和素的相互作用，将其应用于酶联免疫信号放大和光捕获等领域。与间接的化学反应相比，极大减少了对蛋白分子的伤害。
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图 2 (a)特定位点插入非天然氨基酸(KPN)的TMVCP及其自组装示意图；(b，c)该TMVCP突变体组装为盘状(b)及长棒(c)的透射电子显微镜照片[36] Fig.2 (a) Genetic incorporation of KPN into TMVCP and its self-assembly; (b, c) Transmission electron microscope images of the TMVCP mutant assembling into nano-disks (b) and nano-rods (c)[36] |
TMVCP的C端具有容纳少量氨基酸的特性，因此，一些较短的多肽分子可以引入到TMVCP的C端，同时由于C端位于组装体的外侧，使得插入的多肽暴露于TMV突变体外侧，赋予了TMV组装体特殊的功能。例如，在进行TMV表面金属粒子的沉淀时，引入六位组氨酸，利用六位组氨酸与金属粒子较强的相互作用，使金属颗粒在TMV表面进行有效的沉积[37]。王倩课题组[38]将RGD多肽引入到TMV中，利用其作为基底来诱导细胞的分化生长。Zang等[39]将TNT结合多肽引入到TMV中，来捕捉TNT分子，并将其转化为电信号进行输出，从而达到利用TMV作为支架来检测特定分子的目的。值得注意的是，较大多肽片段的引入由于位阻效应很可能会阻碍蛋白的自组装。
4 烟草花叶病毒的化学修饰TMVCP围绕RNA组装为规整棒状结构之后，每个TMVCP在TMV的外表面暴露一个酚羟基(来自于139位酪氨酸残基)，并在TMV内空腔表面暴露2个羧基(来自97位及106位谷氨酸残基)，这3个化学基团是目前已被证明的TMV仅有的3个反应活性位点。外表面的酪氨酸酚羟基可通过芳环的亲电取代反应来修饰，如碘化反应、硝化反应及与重氮盐的反应，内空腔表面谷氨酸上的羧基可以通过与氨基的酰胺化反应被修饰，还可通过配位作用或静电作用负载小分子。通过内、外表面的单修饰或内外表面双修饰，可以在维持TMV形貌和完整性的前提下对TMV实现功能化，扩展TMV的应用领域。
4.1 外表面的化学修饰及应用酪氨酸酚羟基的常见化学反应有碘化反应、硝化反应和重氮化反应(如图 3所示)，其反应特点是高效、高转化率、高选择性。由于大多数病毒富含酪氨酸残基，如MS2噬菌体内空腔有180个活性酪氨酸残基(85位酪氨酸)，M13噬菌体的每个P8蛋白上有2个活性酪氨酸残基(21位和24位酪氨酸)，因此，酪氨酸的偶联反应成为病毒类纳米粒子最常用的化学改性手段。
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图 3 酪氨酸的化学修饰 Fig.3 Bioconjugation of tyrosine residues |
酪氨酸的碘化反应在生物医学领域常被用于放射性碘标记，并进一步用于生物成像。本课题组[40]将TMV与Na125I在Iodogen存在的条件下，于100 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液中, 室温反应10 min，并通过MidiTrap G-25柱分离提纯，获得了125I标记的TMV(125I-TMV)(见图 4a所示)。将该125I-TMV通过尾静脉注射入小鼠体内，通过核素成像，成功得到了TMV在小鼠体内各脏器的分布(见图 4b)。
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图 4 (a) TMV外表面139位酪氨酸残基标记放射性碘示意图；(b)由核素成像获得的TMV在小鼠体内分布图[40] Fig.4 (a) Schematic representation for the 125I labeling of tyrosine 139 of TMV; (b) 125I-TMV biodistribution in BALB/c normal mice[40] |
首先通过酪氨酸酚羟基与苯炔胺的重氮化反应使TMV外表面炔基化，再与含叠氮基的分子进行Cu(Ⅰ)催化的叠氮-炔基环加成反应(Cu(Ⅰ)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)，如图 5所示，这是TMV外表面修饰最常用的方法。其中的炔基化反应分为两步，第一步，在对甲基苯磺酸(pTSA)存在，4 ℃且避光条件下，NaNO2将3-氨基苯乙炔的氨基反应为重氮盐；第二步，将预合成的重氮盐与TMV在0.1 mol/L pH 8.8(或pH 9.0) 且含有0.1 mol/L NaCl的硼酸盐缓冲液中，避光4 ℃反应30 min，经脱盐及透析即可获得外表面炔基化的TMV(TMV-Alkyne)。TMV-Alkyne与叠氮基团的CuAAC反应同样尽量在4 ℃条件下进行，以避免TMV的变性。反应在0.01 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液中进行，并需添加氨基胍、抗坏血酸钠和硫酸铜用于CuAAC反应的催化。反应结束后加入EDTA/NaOH溶液(0.5 mol/L，pH 8.0) 并搅拌5 min以鳌和溶液中的铜离子，之后通过透析使外表面功能化的TMV得以纯化。
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图 5 通过先将酚羟基炔基化、再进行CuAAC反应的方法使TMV外表面功能化 Fig.5 Functionality of TMV exterior surface through the alkynylation of tyrosine and the subsequent CuAAC reaction |
Bruckman等[41]通过外表面酚羟基的炔基化和CuAAC反应, 将PEG2k修饰于TMV的外表面，并同时修饰荧光分子Cy5用于体内跟踪，结果证明, 外表面的PEG化可以延长TMV的半循环时间。长春应化所及美国南卡罗来纳大学的林园及王倩课题组[42]同样通过炔基化后CuAAC反应的方法, 成功将β-环糊精(β-CD)修饰于TMV外表面，进而通过金刚烷(adamantane)与β-CD的主客体相互作用，将荧光分子、化疗药物、肿瘤靶向分子和聚合物分别或同时修饰于TMV的外表面，实现了TMV在治疗和诊断方面的研究。
4.2 内空腔表面的化学修饰及应用TMV内空腔暴露的97位及106位谷氨酸残基具有活性羧基，可通过图 6的多种途径对其改性：(1) 通过羧基与氨基之间的酰胺化反应实现荧光小分子的标记、药物小分子的化学负载等；(2) 通过羧基与丙炔氨之间的酰胺化反应实现TMV内空腔表面的炔基化，进而通过炔基与叠氮基团之间的CuAAC反应实现内表面的功能化；(3) 通过羧基与金属阳离子之间的配位作用或静电相互作用, 实现对金属阳离子类小分子的负载。
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图 6 TMV内空腔谷氨酸残基的化学反应 Fig.6 Bioconjugation reactions of the glutamic acid residues on the TMV interior surface |
本课题组[43]为了研究长径比对棒状纳米粒子胞吞机制的影响，通过羧基与氨基的酰胺化反应将荧光分子罗丹明B(RB)修饰于TMV的内腔，同时通过超声打断和蔗糖梯度离心法制备了直径、表面电荷、刚度完全一致，长径比分别为4、8、17的3种TMV基纳米棒(图 7)，通过与上皮细胞及内皮细胞的共孵育和内吞抑制剂的干预，得到了TMV基纳米棒胞吞机制的尺寸依赖性，为棒状生物纳米粒子的生物医用提供了重要理论基础。此外，Bruckman等[44]通过97位及106位谷氨酸残基与丙炔氨的酰胺化反应，将TMV内表面炔基化，并将磁共振造影剂Gd(DOTA)叠氮化(Gd(DOTA)-N3)，进一步通过CuAAC反应将Gd(DOTA)-N3化学接枝于TMV内空腔，由于TMV对Gd的高效装载，实现了磁共振成像对比度的大幅提高。Czapar等[45]合成了带有更多正电荷的顺铂类药物cis-[Pt(NH3)2Cl(phenanthridine)](NO3)，利用TMV内空腔97位及106位谷氨酸羧基所带的负电荷，通过静电相互作用将该顺铂类药物负载于内腔，每个TMV上的负载效率可达2000 ± 200个药物分子，该药物输送体系可以有效抑制三阴性乳腺癌小鼠的肿瘤生长。
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图 7 (a)TMV内表面标记荧光分子RB示意图；(b)不同长径比TMV的制备并用于研究胞吞机制示意图[43] Fig.7 (a) Schematic illustration of the RB labeling on TMV interior surface; (b) Schematic illustration of preparation of TMV nanorods with different aspect ratios and their internalization mechanisms[43] |
TMV内空腔的化学修饰，其优势不仅在于具有丰富的羧基且可实现特定位点修饰，更有意义的是，TMV的4 nm内空腔可能会产生独特的纳米限域效应，对修饰于内空腔的小分子产生特殊的光学效应。本课题组[46]巧妙地利用TMV 4 nm的内空腔作为限域空间来模拟绿色荧光蛋白的β-桶状结构，通过内表面修饰生色团HBI-en产生了荧光增强现象(图 8)。在该体系中，纳米限域空间和有机溶剂的极性疏水作用共同限制了生色团分子的运动，并促进了激发态质子转移过程，从而模仿绿色荧光蛋白的发光机理，得到了具有新型发光机理的纳米荧光探针。
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图 8 (a)TMV内表面修饰生色团HBI-en并由于其内空腔纳米限域效应产生荧光增强现象示意图；(b)TMV-HBI溶液在日光下发出绿色荧光照片[46] Fig.8 (a) Bioconjugation of TMV interior surface with HBI-en chromophore and the fluorescence enhancement phenomena due to the nano-confinement effect; (b) The photograph of TMV-HBI solution under daylight[46] |
TMV内外表面双修饰常用于药物输送体系或生物成像体系，典型设计是将靶向基团修饰于TMV外表面，药物或成像基团负载于TMV内空腔。通过TMV内外表面双修饰得到的药物输送体系，既可以使装载于内腔的药物通过开放的两端响应体内环境，又可以保护药物在到达靶向部位并释放之前不产生任何药理作用。而通过TMV内外表面双修饰得到的成像系统，由于单个TMV棒状病毒由2130个TMVCP组装而成，且组装结构稳定，因此可以实现成像信号的放大。
本课题组[47, 48]通过TMV的内外表面双修饰构建了两种肿瘤靶向化疗药物载体，如图 9a所示，其中一种将抗癌药物阿霉素(DOX)通过酸敏的腙键(—NH—N=)接枝于TMV内空腔，并将靶向肿瘤及新生血管内皮细胞的环肽RGD(cRGD)化学接枝于TMV外表面。这种化疗药物载体在血液和正常组织的中性pH环境中，酸敏键稳定，药物不被释放；当依靠cRGD的靶向作用到达肿瘤部位后，在肿瘤组织及癌细胞内部较低的pH环境中，酸敏键断裂，抗癌药物释放。荷瘤小鼠实验证明了该药物输送体系能有效抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，且毒副作用极低。
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图 9 (a)由环肽RGD提供肿瘤靶向能力、基于TMV的DOX输送体系示意图[47]；(b)由寡糖提供癌细胞特异性识别的TMV基顺铂输送体系示意图[48] Fig.9 (a) Schematic illustration for the design of cRGD-decorated TMV as a vector for DOX delivery[47]; (b) Schematic illustration for the design of glyco-decorated TMV as a vector for cisplatin delivery[48] |
本课题组构建的另一种肿瘤靶向化疗药物载体如图 9b所示[48]，利用TMV内空腔表面羧基(—COOH)与Pt(Ⅱ)之间的配位作用，将化疗药物顺铂(CDDP)负载于TMV内空腔，同时将与细胞膜糖蛋白之间有特异性识别作用的两种寡糖(甘露糖和乳糖)修饰于TMV外表面。由于羧基的质子化效应，配位键在酸性环境下较易断裂，使该药物输送体系在酸性环境中具有较快的药物释放速率。同时，由于甘露糖(Man)对乳腺癌细胞MCF-7的特异性识别，以及乳糖(Lac)对肝癌细胞HepG2的特异性识别，TMV基顺铂载体CDDP@TMV-Man和CDDP@TMV-Lac分别对MCF-7细胞和HepG2细胞具有特异性增强的内吞效率、细胞增殖抑制率、致凋亡率。
将内外表面双修饰的TMV用于非入侵性的生物成像技术，可以实现成像信号的放大。Bruckman等[49]分别将TMV的内外表面炔基化，进一步通过click反应，将近红外荧光分子Cy5、磁共振成像剂Gd(DOTA)共同化学负载于TMV内腔，并将靶向血管细胞黏附分子-1(VCAM-1) 的配体——VCAM-1多肽修饰于TMV外表面，通过动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型，实现了动脉粥样硬化斑块的分子成像，由于其高对比度，使成像所用剂量比临床建议用量降低了400倍。
5 总结与展望综上所述，通过基因工程手段和化学改性手段均可完成对TMV特定位点的改性，实现TMV的多功能化，扩展TMV在多领域的应用潜能。
基因工程和化学修饰两种手段各有利弊：基因工程手段改性效率高，修饰条件温和，在不伤害蛋白分子的同时，能够使蛋白在宿主体内即完成相应高级结构的折叠，但基因技术门槛较高，且当所表达的多肽较长时，由于位阻和表面电荷的作用很可能会影响蛋白组装体的形貌和稳定性；化学改性相对于基因工程改性更容易实现，且通过化学手段更容易构建多功能化的TMV，但是由于TMV的主要组成部分蛋白质较易变性，因而化学反应对温度、溶剂、盐浓度要求较为苛刻。
近几年，TMV的内外表面改性较多用于生物医用材料的研究，尤其是药物输送体系。那么，如何解决TMV血液循环时间较短的问题，将成为未来TMV研究亟待解决的难题。
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