生物硫醇化合物，如谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和高半胱氨酸(Hcy)，在生理活动中扮演着重要角色，其中GSH是细胞内含量最高的硫醇化合物，在维持生物体内的氧化还原平衡方面起着重要作用[1-4]。当生物体内GSH的含量偏离正常范围时，可能会导致癌症、阿尔茨海默症，以及其它一些疾病的发生[5]。因此，发展有效的方法用于跟踪监测生理环境中GSH显得尤为重要[6-9]。
荧光探针非常适合用于生物体系中检测含巯基的生物分子。已报道的硫醇化合物荧光探针主要利用巯基的强亲核能力，如Michael加成反应[10]、断裂2, 4-二硝基苯磺酸酯[11]、与醛基的环加成反应[12]等等。众所周知，几种硫醇化合物包括GSH、Cys和Hcy具有类似的反应活性，因此选择性检测特定硫醇化合物具有很大的挑战性。
BODIPY染料具有相对较高的摩尔吸光系数和荧光量子产率, 以及生理环境下稳定性好等特性，更重要的是, 可以通过改变BODIPY结构中吡咯环上的取代基，调节BODIPY染料的光物理性质。Yang等[6]设计合成了氯代BODIPY化合物，其可与含巯基的氨基酸发生反应；其中与Cys/Hcy经由芳香亲核取代反应、分子内的芳香碳硫氮转换反应生成氮取代的BODIPY；与GSH只发生芳香亲核取代反应生成硫取代BODIPY。我们课题组同样也发现调节BODIPY结构中取代基的推拉电子能力, 可以有效改变其与亲核试剂的反应活性[7]。为了进一步证实该设计思想，我们研究了新型荧光探针CN-B-Cl，其可与含巯基氨基酸快速反应生成不同产物，进而可高选择性的识别检测GSH。
结合已有的工作[6, 7]，我们推测CN-B-Cl与3种含巯基氨基酸的反应机理如图 1所示。GSH中的巯基能够取代BODIPY中的氯原子，生成硫取代产物，引起荧光信号红移。Cys和Hcy同样可以发生上述的亲核取代反应，然而Cys和Hcy中的氨基因处于合适位置，可进一步经由五元环和六元环过渡态发生分子内的取代反应，生成氨基取代BODIPY，该反应过程能够引起荧光发生蓝移并且强度变弱。需要注意的是GSH中的氨基因距离硫碳键远，不能经由大环过渡态生成氮取代BODIPY。根据BODIPY衍生物发光性能的不同，CN-B-Cl可用来检测GSH。
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图 1 CN-B-Cl与不同氨基酸的反应机制 Fig.1 The reaction mechanism between CN-B-Cl and GSH or Cys/Hcy |
合成中涉及的溶剂和药品都是国产分析纯级别，无水反应所需溶剂均经干燥、重蒸过程。反应均在氩气保护下进行。1HNMR和13CNMR用Bruker AV-400核磁共振波谱仪测定，质谱由Waters LCT Premier XE质谱仪测定。
1.2 目标化合物的合成化合物4的合成可参照文献进行[13]，目标化合物CN-B-Cl的合成路线见图 2。
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图 2 CN-B-Cl的合成路线 (a)丙二腈，哌啶，乙醇，85 ℃; (b)吗啡啉，二氯甲烷，三乙胺；(c)三氯氧磷，吡咯；(d)氯化铜，乙腈，60 ℃；(e)三氯氧磷，1, 2-二氯乙烷，85 ℃；(f)三乙胺，三氟化硼乙醚，二氯甲烷 Fig.2 The synthesis of CN-B-Cl (a) malononitrile, piperidine, ethanol, 85 ℃; (b) morpholine, CH2Cl2, Et3N; (c) POCl3, pyrrole; (d) CuCl2, CH3CN, 60 ℃; (e) POCl3, 1, 2-dichloroethane, 85 ℃; (f) Et3N, BF3·Et2O, CH2Cl2 |
向250 mL茄形烧瓶加入90 mL重蒸乙醇，随后依次加入吡咯醛(0.95 g, 0.01 mol)、丙二腈(0.73 g, 0.011 mol)。待固体溶解后加入2.8 mL哌啶。缓慢升温至85 ℃，反应8 h。反应完全后，将反应体系降至室温，真空下除去溶剂，得到粗产物。层析硅胶柱纯化得到黄色固体化合物1，洗脱剂为PE：EA=20：1，产率为89.7%。
1HNMR(CDCl3, 400 MHz): 9.81(s, 1H), 7.51(s, 1H), 7.31(s, 1H), 7.00(s, 1H), 6.50~6.48(m, 1H); 13CNMR(CDCl3, 100 MHz): 146.1, 130.3, 126.8, 115.6, 114.7, 114.4, 69.7。
1.2.2 化合物5的合成茄形烧瓶中加入苯甲酰吡咯氯(206 mg, 1 mmol)，冰浴下滴加POCl3 (0.136 mL, 1.5 mmol)。滴加完毕将反应体系移至室温搅拌30 min。然后滴加化合物1 (172 mg, 1.2 mmol)的1, 2-二氯乙烷的溶液(30 mL)至上述反应体系中。在惰性气体保护下，缓慢升温至85 ℃，回流反应10 h。反应完成后，冰浴条件下，缓慢加入饱和的NaHCO3溶液，直到反应体系无气泡产生。加入二氯甲烷萃取，有机相用水洗涤3次，分离出二氯甲烷层，无水Na2SO4干燥后，抽滤，蒸除溶剂，得到粗产物化合物5，直接进行下一步反应。
1.2.3 化合物CN-B-Cl的合成量取30 mL重蒸二氯甲烷溶解化合物5并加入到茄形烧瓶中，冰浴条件下，移液枪量取Et3N(0.693 mL, 0.005 mol)滴加至上述体系中，搅拌15 min后，再向反应体系中缓慢滴加BF3·Et2O(0.631 mL, 0.005 mol)，搅拌15 min。将反应体系升温至室温，并继续搅拌12 h。反应完成后，向体系中加入40 mL去离子水，二氯甲烷萃取，有机相用水洗涤3次；二氯甲烷层，用无水Na2SO4干燥。层析硅胶柱纯化得到青色固体，洗脱剂极性为PE：DCM=1：1，产率46.5 %。
1HNMR (CDCl3, 400 MHz):8.29 (s, 1H), 7.69~7.65 (m, 2H), 7.61~7.57 (t, 2H), 7.53~7.52 (m, 2H), 7.16~7.15 (d, 1H), 6.90~6.89 (d, 1H), 6.67~6.66 (d, 1H); 13CNMR (CDCl3, 100 MHz):153.1, 146.8, 145.5, 142.6, 137.6, 136.9, 136.0, 132.2, 131.7, 130.6, 128.9, 128.7, 123.0, 121.3, 113.8, 113.2, 82.8; HRMS (ESI, m/z): [M + Na]+ calcd for C19H10BClF2N4Na: 401.0553, Found: 401.0543。
2 结果与讨论 2.1 CN-B-Cl对GSH、Cys/Hcy的光谱响应如图 3所示，化合物CN-B-Cl在560 nm处有一个强的吸收峰，而当1 mmol/L GSH存在时，CN-B-Cl (10 μmol/L，HEPES/乙腈，体积比为1：1，pH 7.4) 可迅速转化为硫取代产物，反应过程可在1 s内完成。反应过程中，560 nm处的吸收降低，同时在583 nm处出现一个新的吸收峰。CN-B-Cl同样可与Cys/Hcy发生快速反应，生成氮取代产物，伴随着新吸收峰蓝移至528 nm。以上结果表明，CN-B-Cl可通过比色法用以区分GSH和Cys/Hcy。
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图 3 CN-B-Cl在HEPES/乙腈体系中对GSH、Cys/Hcy的紫外光谱响应 Fig.3 UV-Vis spectra changes of CN-B-Cl (10 μmol/L) in the presence of GSH (1 mmol/L) or Cys/Hcy (500 μmol/L) |
同样，GSH、Cys/Hcy可引起探针分子CN-B-Cl荧光的明显变化，如图 4所示。CN-B-Cl在578 nm处有一个强荧光发射峰。向CN-B-Cl的溶液中(10 μmol/L，HEPES/乙腈，体积比为1：1，pH 7.4) 加入1 mmol/L GSH，探针在578 nm处的发光下降，同时在608 nm处出现一个新的发射峰。因此，CN-B-Cl可作为一个基于比值法GSH荧光探针。与此对应，CN-B-Cl与Cys/Hcy反应则主要表现为发光的猝灭和发光位置的蓝移。上述荧光变化均可快速完成，这是因为双氰基的强吸电子效应使得探针CN-B-Cl化学活性较高。总之，CN-B-Cl是一个优良荧光探针，可通过比值法选择性区分GSH和Cys/Hcy。
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图 4 CN-B-Cl在HEPES/乙腈体系中对GSH、Cys/Hcy的荧光光谱响应(λex=510 nm) Fig.4 Fluorescent spectra changes of CN-B-Cl (10 μmol/L) in the presence of GSH (1 mmol/L) or Cys/Hcy (500 μmol/L) |
我们考察了常见氨基酸等干扰物种对GSH响应的影响，结果如图 5所示。只有GSH能引起荧光强度比值I608/I578明显变化，反应前后比值增大近7倍。其它干扰物种存在时，荧光强度比值I608/I578保持基本不变。由此表明，探针CN-B-Cl能够选择性识别GSH。
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图 5 CN-B-Cl对GSH的选择性光谱响应 Fig.5 Ratiometric fluorescence changes (I608/I578) of CN-B-Cl in the presence of biologically relevant analytes 1.Leu; 2.Thr; 3.Tyr; 4.Pro; 5.Lys; 6.Trp; 7.Ala; 8.Glu; 9.Met; 10.Ser; 11.Phe; 12.His; 13.Gly; 14.Arg; 15.NaSH; 16.Cys; 17.Hcy; 18.GSH |
测试CN-B-Cl对GSH光谱响应的灵敏度，结果如图 6所示。随GSH含量从1 μmol/L增加至100 μmol/L，CN-B-Cl在578 nm处的荧光强度值逐渐降低，同时，608 nm处荧光强度缓慢地增加，荧光强度比值I608/I578显著增加。由图 7可以看出，在GSH浓度小于5 μmol/L时，荧光强度比值I608/I578与GSH浓度呈线性关系。根据公式DL = 3σ/k，计算得到检测限为4.82×10-9 mol/L，表明探针CN-B-Cl对GSH呈现高的灵敏度。
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图 6 CN-B-Cl对不同浓度的GSH荧光光谱变化 Fig.6 Fluorescence spectra changes of CN-B-Cl in the presence of various concentrations of GSH |
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图 7 荧光强度比值I608/I578与GSH浓度的线性关系 Fig.7 The ratiometric fluorescence intensity changes (I608/I578) of CN-B-Cl as a function of GSH concentration |
本文从吡咯醛出发，合成了双氰基修饰的BODIPY衍生物CN-B-Cl。实验证实，探针CN-B-Cl具有优良的化学反应活性，能够迅速与含巯基的氨基酸反应。CN-B-Cl能够与GSH迅速发生亲核取代反应生成硫取代BODIPY；而与Cys/Hcy则经由芳香亲核取代反应、分子内的芳香碳硫氮转换反应生成氮取代BODIPY。探针CN-B-Cl在发生硫基或氨基取代过程中，其光物理性质发生显著的变化，因而可有效区分GSH与Cys/Hcy。
致谢 感谢国家自然科学基金(21372083, 21672062) 对本研究的支持。| [1] | Hwang C, Sinskey A J, Lodish H F. Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum[J]. Science, 1992, 257(5076): 1496. DOI:10.1126/science.1523409 |
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