2. 东南大学 生物科学与医学工程学院 生物电子学国家重点实验室, 江苏 南京 210096;
3. 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室, 贵州 贵阳 550002
2. State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science and Medical Engineering, Southeast University, Nanjing 210096, Jiangsu, P. R. China;
3. The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002, Guizhou, P. R. China
量子点(quantum dots, QDs)作为当前纳米生物医学领域中普遍研究的一种纳米荧光材料，具有高的荧光产率、宽的激发光谱、窄的荧光光谱，以及表面易功能化修饰等诸多优点[1-4]，是一种很有发展潜力的荧光探针，已被广泛应用于多个领域：分析领域，如离子、小分子，以及生物分子等检测[5-7]；生物领域，如细胞成像、动物活体成像[8, 9]；能源及光电器件[10, 11]领域等。
α, β, γ, δ-四(1-甲基吡啶嗡-4-基)卟吩对甲苯磺酸盐(TMPyP)是一种水溶性高效光敏剂，为四价阳离子的卟啉类衍生物，能选择性地进入癌细胞的细胞核中，而对正常的上皮细胞几乎没有毒性作用，与核酸具有很好的亲和性，可应用于核酸检测[12]、光动力治疗(PDT)[13]、癌症诊断[14]等方面。由于其荧光特性欠佳，TMPyP本身不能用作DNA荧光探针。目前，在溶液中，基于QDs与TMPyP组装而成的纳米荧光探针已用于DNA检测[15]。在此基础上，我们合成了高量子产率的CdTe量子点，制备出水溶性CdTe-TMPyP复合物荧光探针，对HeLa癌细胞标记成像。结果表明，CdTe量子点具有较好的荧光强度和光稳定性，可用于生物细胞的标记成像，为进一步可视化靶向药物输送及光动力治疗打下基础。
1 实验部分 1.1 试剂及设备碲粉(Te，99.999%，Alfa Aesar)、巯基乙酸(TGA，优级纯，阿拉丁公司)、硼氢化钠(NaBH4，分析纯，南京化学试剂有限公司)、氯化镉(CdCl2，99.99%，Sigma-Aldrich)、TMPyP(分析纯，百灵威科技公司)、鲑鱼精DNA(Sigma-Aldrich公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批号121112)、RPMI-1640培养基(Invitrogen公司，批号785914)、四氮唑蓝(MTT) (FLUCA公司)、乙腈(HPLC)、四丁基六氟磷酸胺(99%，J&K公司)。
量子点的荧光和紫外吸收光谱分别在Hitachi F-7000和Hitachi U-4100光谱仪上测量；量子点形貌在JEM-2100透射电子显微镜上观察；细胞荧光成像采用激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8) 成像系统；CO2培养箱(上海力申公司)；酶标仪(Perkin Elmer, En Vision)用于细胞毒性试验；用扫描电子显微镜(SEM)(日本日立公司S-3000N型)观察细胞形态。
1.2 CdTe量子点的合成水溶性TGA包裹的CdTe量子点参照文献[16]方法合成。将摩尔比为3：1的硼氢化钠和碲粉在冰水浴中反应制得碲氢化纳(NaHTe)溶液。1.2 mmol CdCl2和1.56 mmol TGA溶解在100 mL超纯水中作为前驱液，将pH调为11.3，通入氮气除氧30 min。在搅拌条件下，迅速加入0.6 mmol除氧的NaHTe溶液，并加热至100 ℃回流，反应1.5 h，制备CdTe量子点。
1.3 CdTe QDs-TMPyP体系制备过程及DNA检测CdTe QDs浓度按照文献[17]计算得到，将不同浓度的TMPyP溶液加入到量子点溶液中，量子点的终浓度为0.1 μmol/L，两者充分混合，检测荧光猝灭实验；在荧光恢复实验中，将不同浓度的DNA加入到CdTe QDs-TMPyP体系中，检测荧光强度变化。所有荧光测量实验均在室温条件下进行，激发波长为400 nm，光电倍增管(PMT)电压为700 V，狭缝宽度为5 nm。
1.4 CdTe QDs-TMPyP对HeLa细胞毒性实验HeLa细胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中常规培养，将HeLa细胞以每孔1×104个细胞接种于96孔板，每孔体积200 μL，培养24 h后，加入不同浓度的CdTe量子点和CdTe QDs-TMPyP进行MTT试验，培养24 h后，加入MTT，继续培养4 h，小心弃上清，加入200 μL DMSO溶解。在酶标仪上测定细胞溶液在490 nm吸光度(A)，按照下列公式计算肿瘤细胞存活率：
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取对数生长期的HeLa细胞进行分组培养，加入CdTe QDs-TMPyP为200 nmol/L，培养24 h取样，胰酶消化，经4%多聚甲醛固定1 h，滴加在硅片上，烘干，扫描电镜观察与摄片及能谱分析，加速电压为10 kV。
1.6 CdTe QDs-TMPyP的细胞成像实验将HeLa细胞培养在24孔板中，细胞浓度为1×104个/mL，分别加入200 nmol/L CdTe和CdTe QDs-TMPyP(摩尔比1：1)，培养1 h以及4 h后，吸去培养液，用PBS洗去3次，固定，封片，采用共聚焦荧光显微镜成像。
2 结果与讨论 2.1 CdTe量子点的合成当NaHTe前驱液注入Cd前驱液中，随着反应时间延长，可制备出不同尺寸TGA包覆的CdTe量子点。当反应1.5 h时，可制备出绿色CdTe量子点，透射电子显微镜(TEM)显示其具有很好的单分散性，如图 1A所示，可用于分析检测。通过对量子点的粒径分布进行统计，其粒径约为2.3 nm，如图 1B所示。
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图 1 A. CdTe量子点TEM图，插图:HRTEM；B.量子点粒径分布图 Fig.1 A. TEM image of CdTe QDs, inset: HRTEM image; B. The particle size distribution of CdTe QDs |
从图 2A可以看出，粒径为2.3 nm的CdTe量子点，其第一吸收峰为510 nm, 发射波长的最大发射峰为551 nm，半峰宽约为41 nm，具有较窄的半峰宽，使用罗丹明6G作为参考标准[18]，量子产率为32%，具有较高的量子产率，可用于荧光可视化检测和成像。TMPyP作为卟啉家族的光敏剂之一，带有较强的正电荷，与带负电的巯基乙酸包覆的CdTe量子点静电组装，形成CdTe QDs-TMPyP复合物，当400 nm激发时，量子点荧光猝灭，由于TMPyP的吸收和量子点的发射具有较小的重叠，并且由于TMPyP的最高占据分子轨道(highest occupied molecular orbital, HOMO)和最低未占分子轨道(lowest unoccupied molecular orbital, LUMO)的能级分别为-5.8 eV和-4.0 eV，量子点的价带(valence band, VB)和导带(conduction band, CB)分别为-5.6 eV和-3.4 eV，TMPyP的HOMO和LUMO能级比CdTe QDs的VB和CB分别低0.2 eV和0.6 eV，如图 2B所示。因此可知，量子点和TMPyP之间主要产生光致电子转移[15]，导致QDs/TMPyP复合物的荧光被高效猝灭。
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图 2 A. TMPyP吸收以及量子点的吸收和发射光谱；B. CdTe QDs和TMPyP能级以及两者之间的PIET过程示意图 Fig.2 A. UV-Abs and PL spectra of TMPyP and CdTe QDs; B. PIET mechanism based on energy levels of green CdTe QDs versus TMPyP |
当在0.2 μmol/L CdTe量子点中加入等体积不同浓度的TMPyP时，带正电荷的TMPyP与带负电的CdTe量子点静电组装，形成CdTe QDs-TMPyP复合物，量子点的荧光逐渐减弱，如图 3A所示。当加入0.2 μmol/L TMPyP，即CdTe量子点/TMPyP摩尔比为1：1时，形成CdTe QDs-TMPyP复合物，量子点荧光猝灭到原来的10%，如图 3B所示，并且呈现良好的线性猝灭，R2=0.994，因此，选用CdTe QDs与TMPyP的摩尔比为1：1时组装的CdTe QDs-TMPyP纳米复合物用于DNA检测。当TMPyP浓度大于0.2 μmol/L时，猝灭量子点效率减弱。此外，CdTe QDs-TMPyP复合物在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中表现出良好的时间稳定性，如图 3C所示，为细胞呈现打下良好的基础。当双链DNA存在时，TMPyP与DNA结合，从量子点表面脱附，打断了CdTe QDs和TMPyP之间的PIET过程，量子点荧光恢复，如图 3D所示，在CdTe QDs-TMPyP复合物溶液中加入2.0 nmol/L DNA时，量子点恢复能到原来的90%。图 3D插图所示为在紫外灯下CdTe QDs-TMPyP复合物检测DNA的荧光变化。
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图 3 A. CdTe量子点溶液中加入不同浓度TMPyP后的荧光光谱; B.加入不同浓度TMPyP后相对荧光强度的变化；C.在10%小牛血清的RPMI-1640培养液中CdTe QDs-TMPyP复合物时间稳定性变化；D. CdTe QDs-TMPyP复合物胞外检测DNA的荧光光谱图 插图：在紫外灯下的CdTe QDs-TMPyP复合物检测DNA荧光图片I和I0分别为量子点在TMPyP存在和不存在时的荧光强度 Fig.3 A. Evolution of PL intensity of CdTe QDs by added TMPyP; B. The relationship between the relative PL intensity (I/I0) of CdTe QDs and the TMPyP concentration; C. Stability measurement of CdTe QDs-TMPyP nano-complex with different time in 10% calf serum RPMI-1640 culture medium; D. The PL spectra of CdTe QDs-TMPyP nano-complex for DNA detection Inset: CdTe QDs-TMPyP photographs for DNA detection under UV lamp I and I0 are the PL intensity of CdTe QDs in the presence/absence of TMPyP, respectively |
利用CdTe QDs-TMPyP复合物用于肿瘤细胞成像之前，采用MTT方法，探讨了CdTe QDs和CdTe QDs-TMPyP体系(摩尔比为1：1) 对HeLa细胞毒性研究。如图 4所示，当不同浓度的CdTe QDs和CdTe QDs-TMPyP作用于HeLa细胞24 h后，发现当CdTe QDs和CdTe QDs-TMPyP浓度低于1.0 μmol/L，细胞存活率为92%以上，表现出低的细胞毒性，而当CdTe QDs和CdTe QDs-TMPyP浓度达到10 μmol/L时，细胞存活率只有30%。当低浓度0.2 μmol/L CdTe QDs和CdTe QDs-TMPyP培养24 h后，HeLa细胞存活率在96%，这一结果与Zhou等的研究结果相似[19]，可以进一步对肿瘤细胞成像。
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图 4 不同浓度的CdTe QDs和CdTe QDs-TMPyP复合物对HeLa细胞作用的细胞毒性实验 Fig.4 Cell viability assays of the HeLa cells treated with different concentrations of CdTe QDs and CdTe QDs-TMPyP for 24 h |
当0.2 μmol/L CdTe QDs-TMPyP作用于HeLa细胞24 h后，HeLa肿瘤细胞用扫描电镜观察细胞发现呈圆形，表面不光滑，有丰富的微绒毛及小泡状突起，如图 5A所示，说明细胞生长状态较好，进一步说明0.2 μmol/L CdTe QDs-TMPyP作用于肿瘤细胞对细胞影响较小。以图 5A红色方框为扫描范围，进行细胞内能谱分析，结果如图 5B所示，发现细胞内含有Cd和Te原子，说明CdTe QDs已经进入细胞，进一步说明可以细胞内成像。
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图 5 CdTe QDs-TMPyP作用于HeLa细胞的SEM图(A)和细胞内能谱分析(B) Fig.5 SEM image (A) and EDS analysis (B) of HeLa cancer cells treated with CdTe QDs-TMPyP |
图 6为HeLa细胞对CdTe QDs和CdTe QDs-TMPyP纳米颗粒摄取情况的共聚焦成像图。0.2 μmol/L CdTe QDs培养HeLa细胞4 h后，发现绿色量子点进入细胞并主要分布在细胞质，细胞成像亮度较暗(图 6A)。当0.2 μmol/L CdTe QDs-TMPyP复合物与HeLa细胞共培养1 h后，发现量子点荧光在细胞质和细胞核分布较均匀，说明QDs-TMPyP复合物进入细胞，如图 6B所示。随着QDs-TMPyP复合物与HeLa细胞共培养时间延长至4 h时，发现细胞成像主要在细胞核，且亮度增强，说明QDs-TMPyP复合物进入细胞核，TMPyP插入到细胞核内的DNA，量子点荧光恢复。与单独的CdTe QDs培养4 h相比，细胞成像亮度明显增强，说明QDs-TMPyP复合物比单独的CdTe QDs更有利于进入细胞，更有利于QDs-TMPyP复合物的细胞药物输送和细胞成像，为可视化诊疗奠定基础。
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图 6 CdTe QDs和CdTe QDs-TMPyP纳米颗粒对HeLa细胞共聚焦成像 A. CdTe QDs与HeLa细胞共培养4 h；B、C. CdTe QDs-TMPyP复合物物与HeLa细胞共培养1 h、4 h Fig.6 Confocal images of HeLa cancer cells after incubation with CdTe QDs for 4 h (A), with CdTe QDs-TMPyP for 1 h (B) and 4 h (C) |
本研究制备的巯基乙酸包覆的水溶性绿色CdTe量子点具有高荧光量子产率，并且单分散性好。与TMPyP组装成QDs-TMPyP复合物，通过光致电子转移机制检测DNA，发现QDs-TMPyP复合物更易被HeLa细胞摄取，利用量子点荧光，实现了在细胞核内成像，为宫颈癌细胞药物输送和细胞成像的深入研究奠定基础，为未来实现可视化光动力诊疗一体化提供了巨大的可能。
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