2. 中国科学院 理化技术研究所 中国科学院低温工程学重点实验室, 北京 100190
2. Laboratory of Controllable Preparation and Application of Nanomaterials, CAS Key Laboratory of Cryogenics, Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, P. R. China
原发性肝癌是中国第二大癌症相关致死疾病,全球一半的肝癌发生在我国。经研究人员坚持不懈的努力,肝癌的发病机制和治疗新技术都取得了一定进展,但它仍然是一个高侵略性的恶性肿瘤[1, 2]。最近,微波消融成为一种非常有效的热消融技术,它具有创伤小、升温迅速、热效率高、辐射低等优势[3-5]。微波消融在我国普遍用于原发性肝癌治疗,并且越来越多地在全世界使用[6-9]。
为了实现更好的微波消融效果,我们最近报道了基于离子“限域效应”的微波增敏剂,能够有效提高微波-热转换效率,扩大肿瘤消融面积,防止因不完全消融引起的肿瘤残余[10-14]。
微波增敏研究在皮下移植瘤模型中取得了显著的癌症抑制能力,但是在治疗肝脏原位肿瘤中遇到较大的技术难题。肿瘤热消融过程中热量的不当损失是影响其消融效果的最大障碍。在原发性肝癌中有大量血管[15, 16],来自宿主器官丰富的血流将带走微波消融区域的热量,这种冷却效应将大大减少坏死区的面积。因此,局部加热不足会明显减小坏死体积,使原发肿瘤相邻的显微转移结构残存。基于原发性肝癌的生理特征,需将微波增敏的栓塞剂给药到肿瘤部位,阻断血流引起的冷却效应,同时使肿瘤部的微波-热转换效率增强,有效扩大肿瘤坏死体积,协同治疗原发性肝癌。
本文制备了一种具有微波增敏功能的mPEG-PLGA微球,该微球具有良好的生物安全性。体内外微波-热转换实验证明其具有良好的微波增敏特性。将所制备的微球经肝动脉超选择给药到肿瘤部位,阻断肿瘤供血,减少由血流引起的热损失,微波消融后扩大消融体积,实现了微波消融与栓塞协同治疗原发性肝癌。基于这些发现,具有微波增敏功能的mPEG-PLGA微球有望成为新的栓塞剂用于治疗原发性肝癌。
1 实验部分 1.1 二硫化钼纳米片的制备二硫化钼纳米片的制备采用简单的水热合成法[17]。称取1.8 g钼酸钠和2.4 g硫脲,溶于50 mL去离子水,加入30 mL盐酸(1 mol/L),形成前驱体。将前驱体溶液倒入反应釜中,在200 ℃培养箱内反应20 h。将离心分离后所得固体产物再用去离子水清洗5次,分散到去离子水中储存备用。
1.2 微波增敏的栓塞微球的制备采用改进后的复乳法制备mPEG-PLGA栓塞微球[18]。准确称量200 mg mPEG-PLGA溶于4 mL二氯甲烷,形成均一油相;称量5.7 mg二硫化钼纳米片分散于1 mL NaCl溶液(3%)中,形成内水相;冰浴下,将内水相与油相混合,180 W探头超声乳化90 s,形成均一乳液;将上述乳液加入到含0.1% PVA(分子量:30000~70000, 水解度:87%~89%)的外水相中,机械搅拌(1200 r/min)4 h, 使二氯甲烷完全挥发。离心后再用去离子水清洗5次,分散到去离子水中形成浓度为30 mg/mL的混合物,-20 ℃下储存。
1.3 表征mPEG-PLGA微球的形貌分别用光学显微镜和扫描电子显微镜进行观察,其中微球的粒径分布通过使用Nano Measure 1.2软件测量超过150个微球而获得。能量色散X-射线能谱仪用来确定微球中元素分布和种类。
1.4 体外微波-热转换将35 mg mPEG-PLGA微球分散于1 mL生理盐水中,置于薄底容器,微波(1.8 W, 450 MHz)辐射5 min,采用红外热成像仪监测温度变化。
1.5 微波消融ICR小鼠皮下H22肿瘤将荷H22肿瘤的ICR小鼠随机分为3组,每组5只,包括:对照组(注射生理盐水)、微波组(注射生理盐水后微波消融)、材料+微波组(注射mPEG-PLGA微球后微波消融)。微波参数如下:2 W,2450 MHz,5 min。在微波消融过程中,用红外热成像仪实时监测温度变化。记录16天内小鼠肿瘤体积和体重的变化。
1.6 栓塞与微波消融协同治疗兔子VX-2肝脏原位移植瘤实验选用荷VX-2肝脏原位移植瘤的新西兰白兔为动物模型,待肿瘤直径大于1 cm时,将兔子随机分为两组:(1)微波组(注射生理盐水);(2)材料+微波组(注射mPEG-PLGA微球)。经微波(15 W, 2450 MHz)消融2 min后,核磁共振成像(MRI)用于监测肿瘤消融大小,治疗6天后评价治疗效果。
2 结果与讨论 2.1 微波增敏的微球的表征本文设计并构建了具有微波增敏功能的mPEG-PLGA微球,它包括:(1)生物相容性良好的可降解mPEG-PLGA骨架,可用于包覆亲水和疏水两种成分;(2)分散于生理盐水中二硫化钼纳米片。mPEG-PLGA微球在光学显微镜下(图 1a),呈单分散的规则的球形,且分布较均匀。扫描电子显微镜下(图 1b)呈表面光滑的规则球形。用Nano Measure 1.2软件测量超过150个微球直径后,得到粒径分布如图 1c所示,微球的平均粒径约为63 μm。图 1d是微球的元素面分布,证明了微球中所含有的元素种类及分布情况。其中,紫色代表碳元素,来自于mPEG-PLGA骨架;绿色代表钠元素,来自于微球内的氯化钠;红色代表钼元素,来自于二硫化钼纳米片。以上表征说明已成功制备包覆生理盐水和二硫化钼纳米片的mPEG-PLGA微球。
为了研究微球的微波-热转换能力,在相同的微波参数下, 分别对生理盐水和mPEG-PLGA微球进行微波辐射,温度的变化由近红外成像仪监测。如图 2a所示,两组实验的升温梯度ΔT(最终温度-初始温度)分别达到18.6 ℃和27.1 ℃。实验过程中,微球中的Na+和Cl-在微波辐射下会产生震动摩擦,从而产生热量,当将其限定在有限空间内时,离子间的碰撞频率会增加,产生更多的热量。此外,二硫化钼片是一种二维结构材料,具有大的比表面积,当它与无机盐溶液(含有Na+和Cl-)混合后,无机离子进入到二硫化钼片层之间,在微波辐射下,层间的无机离子发生碰撞摩擦的频率增大,微波-热转换效率提高[17]。图 2b是对应微波升温曲线的红外热成像,能更加直观地观察温度的变化。
用ICR小鼠皮下H22肿瘤初步评价mPEG-PLGA微球的微波增敏效果。图 3a是微波消融5 min时肿瘤部位的红外热成像,与微波组相比,材料+微波组消融部位的高温范围明显更大。治疗16天内,小鼠肿瘤体积变化如图 3b所示,与对照组相比,微波组的肿瘤生长得到明显抑制,但随着时间的延长,肿瘤开始逐渐长大,且生长速率变快;而微球+微波组的肿瘤抑制率达到了100%,这是微球对微波增敏的结果。三组小鼠的体重变化如图 3c,随着治疗时间的延长,小鼠的体重正常增加,因此,mPEG-PLGA微球没有明显的毒性。术前和术后16天,各组小鼠的代表性照片如图 3d所示,其结果与图 3b一致。说明具有微波增敏功能的mPEG-PLGA微球能有效增强微波消融效果。
相对于皮下肿瘤模型,原位瘤所处的环境要复杂得多,肿瘤周围有丰富的血管,微波在肿瘤部位所产生的热量会随血液散失,影响热消融的效果。以新西兰白兔VX-2肝脏原位移植瘤为模型,将mPEG-PLGA微球经股动脉穿刺,超选择给药到为肿瘤供血的血管。微波消融肿瘤时,微球的微波增敏功能及栓塞阻断血流散热特性将大大提高治疗效果。
如图 4a所示,栓塞前肿瘤周围供血十分丰富,栓塞后肿瘤周围血管立即“消失”,这意味着mPEG-PLGA微球阻断了肿瘤的供血,使肿瘤处于“孤立”的饥饿状态。平行设置微波和材料+微波两组实验,用MRI监测治疗后6天肿瘤消融情况。如图 4b所示,微波组中肿瘤在两个方向上的坏死直径分别为11.18和11.78 mm;而微波+材料组的肿瘤在两个方向上的坏死直径分别为21.85和15.76 mm,坏死面积明显扩大。微波热疗与栓塞协同作用的结果表明,这种新型mPEG-PLGA微球有助于高效快速治疗原发性肝癌,扩大微波消融面积。
本文通过复乳法制备了生物安全性良好的mPEG-PLGA微球,包覆了分散于生理盐水中的二硫化钼纳米片后,微球的平均粒径为63 μm。通过微球自身的孔隙结构和二硫化钼纳米片的片层结构限制离子在微波场下的运动,增加了离子间的相互摩擦碰撞,因而具有微波增敏功能。以ICR小鼠皮下H22肿瘤为模型,在mPEG-PLGA微球辅助下,能有效抑制肿瘤生长。以新西兰白兔VX-2肝脏原位移植瘤为模型,经肝动脉超选择给药后,DSA图像显示肿瘤和周围血管迅速“消失”,微球具有良好的栓塞效果。微波消融患处,与微波对照组相比,材料+微波组6天后肿瘤坏死面积明显扩大,微波消融与栓塞协同治疗效果显著。本文开发的具有微波增敏功能的mPEG-PLGA微球实现了微波热疗与栓塞协同治疗原发性肝癌。
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