2. 山西大学 环境科学研究所, 山西 太原 030006
2. Institute of Environmental Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, Shanxi, P. R. China
pH荧光探针具有操作简单、高灵敏度、高信噪比等特点，尤其是荧光探针与激光共聚焦细胞成像技术相结合，已经成为分子水平监测细胞内pH值的重要手段[1-3]。半花菁染料由于具有发光稳定、水溶性好以及对溶液环境比较敏感等特点，成为检测溶液pH的首选探针[4-6]。
大多数半花菁类pH荧光探针是通过吲哚环上未被取代的N原子发生质子化/去质子化作用实现pH值检测的[7-9]。本文以吲哚(苯并吲哚)衍生物和4-羟基苯甲醛为原料，通过一步反应合成半花菁类染料化合物1和2，其分子结构中含有杂环上未被取代的N原子和酚羟基的两个pH敏感点。然后利用紫外吸收和荧光光谱研究了其作为pH探针的光谱特性。
1 实验部分 1.1 试剂与仪器主要试剂有4-羟基苯甲醛、1, 1, 2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚、2, 3, 3-三甲基-3H-吲哚、哌啶、无水乙醇。原料和试剂均为分析纯，购于Aldrich公司。实验用水为二次蒸馏水。
仪器：日本岛津UV-265紫外-可见分光光度计，日立F4500荧光分光光度计，瑞士Bruker Avance DRX600 MHz超导核磁共振仪，布鲁克Bruker Autofex NAILD-TOF质谱仪，梅特勒-托利多pH计。
1.2 实验方法 1.2.1 合成方法探针1和2的合成路线如Scheme 1所示。4-羟基苯甲醛(0.732 g，6 mmol)、吲哚衍生物(5 mmol)和1.5 mL哌啶在25 mL无水乙醇中加热回流20 h[10]，冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，得到固体粗产品后用柱层析纯化，展开剂为V(二氯甲烷):V(乙酸乙酯)=1:1，得到目标化合物1和2。
|
Scheme 1 探针1和2的合成 Scheme1 Synthesis of probe 1 and 2 |
探针1(产率65.5%): 1HNMR (400 MHz, DMSO)：7.60~7.68 (m, 3H), 7.43~7.48 (m, 2H), 7.29 (t, J=14.4, 1H), 7.19 (t, J=14.3, 1H), 7.02 (d, J=17.6, 1H), 6.81 (d, J=8.0, 2H), 5, 75 (s, 1H), 1.38 (s, 6H)。13CNMR (100 MHz, CDCl3)：166.9, 151.3, 146.1, 130.8, 129.9, 129.5, 125.8, 124.7, 123.7, 122.5, 119.0。HRMS (MALDI-TOF) for C18H17NO：calcd. 263.1310 [M + H]+, found: 264.1379。
探针2(产率60%): 1HNMR (400 MHz, DMSO)：8.13(d, J=8.4, 1H), 7.99(d, J=8.0, 1H), 7.88~7.93 (m, 1H), 7.73~7.78 (m, 2H), 7.64~7.66 (m, 2H), 7.56~7.60 (m, 1H), 7.44~7.48 (m, 1H), 7.14 (d, J=16.4, 2H), 6.81(d, J=8.4, 2H), 1.58 (s, 6H)。HRMS (MALDI-TOF) for C22H19NO：calcd. 313.1467 [M + H]+，found: 314.1537。
1.2.2 紫外-可见和荧光光谱检测方法将探针1和2溶于DMF中，制得10 mmol/L的储备液。在pH滴定实验中，取2 μL探针储备液，用水/DMF (9/1, 体积比)体系稀释到10 μmol/L，定容至2 mL。所需溶液的pH值通过加入一定量的NaOH (0.1 mol/L)或HCl (0.1 mol/L)调节。激发和发射狭缝宽度均为5 nm，激发波长分别为380 nm (1)和400 nm (2)。所有光谱实验均在室温下进行。
2 结果与讨论 2.1 紫外-可见吸收光谱图 1是探针1和2在水/DMF (9/1, V/V)体系中随pH变化的紫外-可见吸收光谱图。
|
图 1 在水/DMF (9/1, V/V)溶液体系中，探针1 (a、b)和探针2 (c、d)从中性到酸性和从中性到碱性随pH变化的紫外-可见吸收光谱图 内图：探针1和2摩尔吸光系数(ε)随pH变化的拟合曲线 Fig.1 Change of the absorption spectra of 1 (a、b) and 2 (c、d) in H2O/DMF (9/1, V/V) with pH Inset: sigmoidal fitting of the pH-dependent molar extinction coefficient ε |
探针1在pH=7的中性溶液中的最大吸收峰位于358 nm。当溶液pH从7降低到1时，358 nm处的吸收峰强度减弱，同时在420 nm处产生了新的吸收峰且峰强度增强。峰位置红移62 nm，在380 nm处出现一个明显的等吸收点。同时，溶液颜色由无色变为黄色(图 1a)。当溶液pH由7增大到13时，探针1的紫外吸收光谱随pH的变化也呈现比率变化，在400 nm处出现了一个新峰，吸收峰位置红移42 nm。等吸收点位于375 nm处(图 1b)。
探针2与探针1结构类似，由于共轭体系增大，导致最大吸收波长红移，摩尔吸光系数增加。在pH=7的中性溶液中，探针2呈现出两个峰，分别位于376 nm、306 nm。pH变化时的比率响应特性与探针1相似(图 1c、d)。
2.2 荧光光谱 2.2.1 光稳定性研究通过测量探针1和2在2 h内随时间变化的荧光强度值，对探针的光稳定性进行了考察。如图 2所示，在水/DMF (9/1, 体积比)体系中，pH=3.5、7.0和10.5时，2 h内探针1和2分别在540 nm和570 nm处的荧光强度值基本保持不变，说明探针在外界空气下和溶液体系中具有很好的光稳定性。
|
图 2 在pH 3.5、7和10.5的水/DMF (9/1, V/V)体系中，10 μmol/L的1 (a)和10 μmol/L的2 (b)分别在540 nm和570 nm处的荧光强度随时间的变化 Fig.2 Changes of the fluorescence intensity with times for 10 μmol/L 1 (a) and 10 μmol/L 2 (b) in H2O/DMF (9/1, V/V) at pH 3.5, 7 and 10.5, respectively |
在水/DMF (9/1, V/V)体系中分别考察了探针1和2对pH响应的荧光光谱。探针1和2在不同pH中能快速响应，实验过程中，将探针加入不同pH溶液体系，立即出现相应的颜色变化，测定光谱可知强度已经达到稳定。
在中性条件下，探针1的荧光发射位于510 nm处(λex=380 nm)。当溶液从中性变为酸性时，荧光发射峰从510 nm逐渐红移至540 nm(图 3a)。当溶液从中性变为碱性时，荧光发射峰从510 nm红移至545 nm，且荧光发射强度显著增强，溶液在紫外灯下的荧光也更亮(图 3b)，说明探针1在碱性环境中对pH变化更灵敏。
|
图 3 在水/DMF (9/1, V/V)体系中，探针1 (10 μmol/L)(a、b)和探针2(10 μmol/L) (c、d)从中性到酸性和从中性到碱性随pH变化的荧光光谱图，激发波长分别为380 nm (1)和400 nm (2) 内图：探针1和2的荧光强度随pH变化的Sigmoidal拟合曲线 Fig.3 Change of the fluorescence spectra of 10 μmol/L 1 (a and b) and 10 μmol/L 2 (c and d) in H2O/DMF (9/1, V/V) with pH Inset: sigmoidal fitting of the pH-dependent fluorescence intensity for probe 1 and 2, respectively |
探针2在中性条件下，荧光发射位于540 nm处(λex=400 nm)，溶液在紫外灯下的荧光为橙黄色。当溶液变为酸性时，荧光发射从540 nm明显红移到590 nm且强度减弱(图 3c)，说明探针2在酸性环境中对pH变化更灵敏。在碱性条件下也呈现出与探针1相似的pH荧光响应特性(图 3d)。
2.2.3 探针1和2光学性能的比较表 1对探针1和2的光学性质进行了比较，包括最大吸收波长(λabs)和发射波长(λem)、Stokes位移、摩尔吸光系数(ε)。结果表明，与探针1相比，探针2的最大吸收、发射峰明显向长波方向移动，摩尔吸光系数更大。
|
表 1 探针1和2的光学性能比较 Table 1 Comparison of the photophysical properties of 1 and 2 |
根据紫外吸收光谱图和朗伯-比尔定律，计算了探针1和2在不同pH条件下的摩尔吸光系数(ε)。根据ε对pH变化的Sigmoidal拟合曲线(图 1内图)和荧光强度对pH变化的Sigmoidal拟合曲线(图 3内图)分别计算了探针1和2在酸性和碱性条件下的pKa值[9]，如表 2所示。结果表明，由两种方法计算得到的pKa值基本一致。
|
|
表 2 探针1和2的pKa值和线性范围 Table 2 The pKa value and linear range of probes 1 and 2 |
根据荧光光谱图 3，探针1和2随pH变化的线性拟合如图 4所示，响应范围如表 2所示。从图 4可知，探针1对碱性条件更敏感，探针2对酸性条件更敏感，与荧光光谱结果一致。
|
图 4 探针1 (a)和2 (b)荧光强度随pH变化的线性关系 Fig.4 The good linearity between fluorescence intensity and pH of 1 and 2 |
可逆性是衡量pH荧光探针性能的重要指标。通过快速改变体系pH值，分别考察了探针1和2在酸性和碱性条件下的可逆性。如图 5(a)所示，pH从7变化到2时，探针1在540 nm处的荧光强度升高，pH再增大到7时，荧光强度降低。5次循环改变pH值后，酸性条件下仍然有99.5%的荧光强度成功恢复。此外，探针对不同pH的响应和荧光恢复时间均很短。同时，溶液颜色也随着体系pH值的改变在黄色(酸性)和无色(中性)之间重复变化。图 5(b)、(c)、(d)也表现出类似的结果。这些结果表明探针1和2对pH的响应具有很好的可逆性。
|
图 5 10 μmol/L的1在水/DMF (9/1，V/V)体系中随pH在2~7(a)和7~13(b)之间变化时，540 nm处荧光强度的变化；10 μmol/L的2在PBS/DMF (9/1, V/V)体系中随pH在2~7(c)和7~12 (d)之间变化时，分别在540 nm、570 nm处荧光强度的变化 Fig.5 (a) Changes of the fluorescence intensity at 540 nm for 10 μmol/L 1 in PBS/DMF (9/1, V/V) between pH 7 and 2; (b) changes of the fluorescence intensity at 540 nm for 10 μmol/L 1 in PBS/DMF (9/1, V/V) between pH 7 and 13; (c) changes of the fluorescence intensity at 540 nm for 10 μmol/L 2 in PBS/DMF (9/1, V/V) between pH 7 and 2; (d) changes of the fluorescence intensity at 570 nm for 10 μmol/L 2 in PBS/DMF (9/1, V/V) between pH 7 and 12 |
如Scheme 2所示，探针分子内存在着杂环N原子和酚羟基两个pH敏感点，在酸性条件下杂环N原子发生质子化，在碱性条件下酚羟基去质子化，导致在酸性、碱性溶液中探针分子内推-拉电子效应增强，吸收光谱和荧光光谱明显红移，呈现出酸碱两个pKa值。
|
Scheme 2 探针1随pH变化的酸碱平衡 Scheme2 The acid-base form equilibrium using probe 1 as an example |
通过简便的方法合成了水溶性好、发光稳定的半花菁染料pH荧光探针1和2。随着溶液从中性变化到酸性或者从中性变化到碱性，两个探针的荧光光谱都逐渐红移，对溶液pH呈比率变化，溶液颜色也出现比色变化。探针1的pKa值为3.81和10.01，pH检测范围为3.72~4.68和9.29~10.88。探针2的pKa值为4.03和10.47，pH检测范围为3.56~4.63和10~10.98。探针对pH的检测是通过吲哚环上未被取代的N原子以及酚羟基的质子化/去质子化效应实现的，都具有较大的Stokes位移和高灵敏度等特点。本研究结果为探针在细胞和组织内的pH检测应用提供了参考。
| [1] | Han J, Burgess K. Fluorescent indicators for intrancellular pH[J]. Chemical Reviews, 2010, 110(5): 2709–2728. DOI:10.1021/cr900249z |
| [2] | Li X H, Gao X H, Shi W, Ma H M. Design strategies for water-soluble small molecular chromogenic and fluorogenic probes[J]. Chemical Reviews, 2014, 114(1): 590–659. DOI:10.1021/cr300508p |
| [3] | Han J, Loudet A, Barhoumi R, Burghardt R C, Burgess K. A ratiometric pH reporter for imaging protein-dye conjugates in living cells[J]. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(5): 1642–1643. DOI:10.1021/ja8073374 |
| [4] | Hilderbrand S A, Weissleder R. Optimized pH-responsive cyanine fluorochromes for detection of acidic environments[J]. Chemical Communications, 2007, 26(26): 2747–2749. |
| [5] | Liu X D, Xu Y, Sun R, Xu Y J, Lu J M, Ge J F. A coumarin indole-based nearinfrared ratiometric pH probe for intracellular fluorescence imaging[J]. Analyst, 2013, 138(21): 6542–6550. DOI:10.1039/c3an01033c |
| [6] |
曾科, 周彬彬, 龙一国. 基于吲哚半花菁结构的比值式pH荧光探针[J]. 应用化工, 2014, 43(8): 1526–1530.
Zeng K, Zhou B B, Long Y G. Ratiometric pH fluorescent probe based on indole hemi-cyanine derivative[J]. Applied Chemical Industry, 2014, 43(8): 1526–1530. |
| [7] | Guo Z Q, Park S, Yoon J, Shin I. Recent progress in the development of near-infrared fluorescent probes for bioima-ging applications[J]. Chemical Society Reviews, 2014, 43(1): 16–29. DOI:10.1039/C3CS60271K |
| [8] |
王炳帅, 王丽, 吴彤, 杨志刚, 彭孝军. 苯乙烯类菁染料pH探针的合成与活细胞成像[J]. 高等学校化学学报, 2016, 31(6): 1148–1151.
Wang B S, Wang L, Wu T, Yang Z G, Peng X J. Synthesis of pH probe based on fluorescence image styrylcyanine dyes and in live cell[J]. Chemical Journal of Chinese Universities, 2016, 31(6): 1148–1151. DOI:10.7503/cjcu20160180 |
| [9] | Fan L, Fu Y J, Liu Q L, Lu D T, Dong C, Shuang S M. Novel far-visible and near-infrared pH probes based on styrylcyanine for imaging intracellular pH in live cells[J]. Chemical Communications, 2012, 48(91): 11202–11204. DOI:10.1039/c2cc35363f |
| [10] | Fan L, Liu Q L, Lu D T, Shi H P, Yang Y F, Li Y F, Dong C, Shuang S M. A novel far-visible and near-infrared pH probe for monitoring near-neutral physiological pH changes:imaging in live cells[J]. Journal of Materials Chemistry B, 2013, 1(34): 4281–4288. DOI:10.1039/c3tb20547a |