影像科学与光化学  2018, Vol. 36 Issue (4): 324-330   PDF    
C70富勒醇对小鼠心脏毒性的研究
郭君1,2, 周悦2,3, 杨冬芝1, 甄明明2,3, 许辉2, 王春儒2,3     
1. 徐州医科大学 新药研究与临床药学重点实验室, 江苏 徐州 221004;
2. 中国科学院 化学研究所 分子纳米结构与纳米技术院重点实验室, 北京 100190;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
摘要: 研究C70富勒醇(简写为C70-OH)在常规治疗剂量下对小鼠心脏功能的影响。通过对小鼠行为学的观察和对心脏系数、血生化指标、心脏组织病理学和组织透射等的检测,结果显示常用的小分子血管阻断剂康普瑞汀磷酸二钠(CA4P)对心肌有明显损伤,而C70-OH未表现出明显的心脏毒性。
关键词: C70富勒醇     病理学变化     组织透射     心脏毒性    
Cardiac Toxicity Study of C70 Fullerenol Nanoparticles in Mice
GUO Jun1,2, ZHOU Yue2,3, YANG Dongzhi1, ZHEN Mingming2,3, XU Hui2, WANG Chunru2,3     
1. Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu, P. R. China;
2. Key Laboratory of Molecular Nanostructure and Nanotechnology, Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, P. R. China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, P. R. China
*Corresponding author: YANG Dongzhi, E-mail: dongzhiy@xzhmu.edu.cn; ZHEN Mingming, E-mail: zhenmm@iccas.ac.cn; WANG Chunru, E-mail: crwang@iccas.ac.cn
Abstract: The cardiac effect of C70 fullerenol nanoparticles (C70-OH NPs) was studied in mice. After treated with the C70-OH fullerene of normal therapeutic dose, behavioral observation, cardiac coefficient, blood biochemical changes, pathological changes and tissue transmission of mice were detected. The results showed that the commonly used small molecule vascular blocker combretastatin disodium phosphate (CA4P) significantly damaged the myocardium, while C70-OH did not show significant cardiotoxicity.
Key words: C70 fullerenol     pathological changes     tissue transmission     cardiac toxicity    

富勒烯自1985年被发现后,由于在物理和化学方面具有特殊性质,引起了研究者的广泛重视。目前,经不同表面修饰的富勒烯已在抑制HIV病毒[1]、抗菌[2]、抗氧化等方面表现出优异的性能,并在细胞保护[3]、器官[4]及骨髓[5]保护和光动力肿瘤治疗中具有一定作用[6, 7]。2005年,赵宇亮课题组研究发现,羟基化修饰的金属富勒烯Gd@C82(OH)22具有抑制肿瘤生长的作用[8]。2015年,本课题组报道了基于射频辅助的金属富勒烯纳米颗粒阻断肿瘤血管的技术[9],在该工作中,金属富勒烯作为一种血管阻断剂,能在短时间内有效地破坏肿瘤血管,从而切断肿瘤组织的营养及氧气供应,达到抑制肿瘤生长的目的。由此可见,金属富勒烯及富勒烯类材料,有望在肿瘤血管阻断领域发挥潜在的优势。

肿瘤血管阻断疗法是一种被广泛认可的有效肿瘤治疗方法之一,目前血管阻断剂以小分子血管阻断剂(vascular disrupting agents, VDAs)居多,这类药物一般起效快, 对进展性疾病疗效相对较好[10],但在临床试验中,此类小分子VDAs均表现出不同程度的肿瘤疼痛及剂量相关的毒性,表现为如头痛、恶心、呼吸困难等不良反应,其中最为严重的是胸痛或心血管反应[11],包括高血压、心动过速、缓慢性心律失常、心房颤动、心肌梗死等严重的心脏毒性,限制了其临床应用。

本实验前期研究发现,C70-OH具有良好的血管阻断性能,因而具有较强的抗肿瘤效果。但该材料是否亦存在小分子VDAs的潜在心脏毒性,未见相关文献报道。在本实验中,我们选取以C70-OH为代表的富勒烯纳米材料,系统地研究了其在常规治疗剂量下对小鼠心脏功能的影响,并与常用的小分子血管阻断剂康普瑞丁磷酸二钠(CA4P)进行比较。通过小鼠心肌酶水平、氧化应激及组织病理学等变化,我们发现C70-OH未表现出明显的心脏毒性,而CA4P出现对心肌的明显损伤。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

C70-OH纳米材料为实验室自制;CA4P,上海源叶生物科技有限公司;谷草转氨酶(AST)试剂盒、肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒、高敏肌钙蛋白T(TNT-HS)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、羟丁酸脱氢酶(a-HB-DH)试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒,英科新创科技有限公司。

全自动多功能酶标仪(Multiskan MK3, Thermo);电热恒温培养箱(DH4000A, 天津泰斯特);小型振荡器(MH-2, Qilinbeier);数字切片扫描设备(C13140-01, Hamamatsu);透射电子显微镜(Tecnai Spirit, FEI);电子天平(ME104, Mettler-Toledo);纳米粒度及电位分析仪(ZS90, Malvern);原子力显微镜(NanoWizard 4 NanoScience, JPK)。

1.2 实验方法 1.2.1 材料制备及表征

参考文献[8]报道的方法制备C70富勒醇:在甲苯溶液中将C70与浓度为50%的NaOH溶液混合,加入少量相转移催化剂四甲基氢氧化铵(TBAH),搅拌24 h后,加入乙醇沉淀产物。透析除去过量NaOH,得到产物C70-OH,冷冻干燥保存。通过纳米粒度及电位分析仪和原子力显微镜(AFM)来考察C70-OH的粒径大小和稳定性。

1.2.2 动物饲养及分组给药

BALB/c小鼠18只,雌雄各半,体重20±2 g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司。BALB/c小鼠饲养于中国科学院过程工程研究所清洁级动物房内。饲养温度维持在22 ℃左右,相对湿度维持在60%左右,每日人工昼夜各12 h。整个实验过程中,小鼠自由饮食饮水,实验前小鼠饲养一周以适应环境。所有的实验操作都是按照中国科学院过程工程研究所实验动物关怀和使用指南进行的。

将18只小鼠随机分为3组(每组6只,雌雄各半),分别为C70-OH组、CA4P组和生理盐水对照组。C70-OH给药量参考相关富勒烯研究,并根据本实验室相关肿瘤治疗研究结果确定[7, 9]。取C70-OH粉末适量,生理盐水溶解混合均匀后稀释成4 mg/mL浓度给药,以0.1 mL/10(g·bw)体积单次尾静脉注射,观察14天。CA4P组静脉注射康普瑞汀磷酸二钠(CA4P)120 mg/kg。

1.2.3 小鼠存活率、体重变化百分比和心脏指数

在给药观察期间关注小鼠的死亡情况以及给药前后体重的变化。14天后取小鼠心脏,用冰生理盐水冲洗、拭干,称重后进行脏器系数分析。

1.2.4 心肌酶谱和氧化应激水平检测

小鼠给药后,在第14天,摘眼球取血约0.5 mL,置于离心管中,静置分层。在2500 r/min下离心12 min,取上层血清,采用全自动生化分析仪以及相应试剂盒测定心脏相关项生化指标,包括:AST、CK-MB、T(TNT-HS)、LDH和a-HB-DH。并采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量,黄嘌呤氧化酶法测定T-SOD活力。

1.2.5 病理学检查

小鼠处死后,取小鼠心脏于4%多聚甲醛固定液中,随后脱水石蜡包埋,切片后HE染色,光镜下观察各组织结构和形态改变。

1.2.6 电镜观察

小鼠处死后,立即取出心脏组织,按照透射电镜标本取材操作规程,将心尖部位制成1×1×1 mm3正方体组织小块,置于透射电镜专用固定液中,经脱水、包埋、切片后染色,透射电镜下观察超微结构变化。

1.3 统计学分析

利用SPSS 19.0进行分析, 以p < 0.05时认为差异具有统计学意义。实验结果均用Mean±SD表示。

2 结果与讨论 2.1 C70-OH的制备和表征

我们通过纳米粒度及电位分析仪和原子力显微镜来考察所制备的C70-OH的粒径大小和Zeta电势,通过热重和元素分析判断分子式。如图 1所示,经AFM测定,C70-OH的高度6~37.5 nm,直径40~80 nm,且颗粒均一性较好;粒度仪结果显示,C70-OH的平均水合粒径为136.4 nm,这是因为纳米颗粒表面存在羟基官能团,在溶液中由于氢键的作用会倾向于自组装形成尺寸更大的纳米颗粒,其水合粒径的测定中包含了纳米颗粒表面包围的水分子层,所以整体粒径比C70-OH的实际尺寸显得更大;经电位测定,C70-OH纳米颗粒的Zeta电势为-55.6 mV,说明在水溶液中此纳米颗粒能稳定存在。根据元素分析结果(图 1e):C 53.55%,H 3.19%,N < 0.3%,结合热重分析、微商热重分析曲线(图 1d)计算C70(OH)x的羟基数目。从热重分析可知,C70(OH)x固体粉末中含11.8%的水,约为10个水分子,结合元素分析中H含量推算属于羟基中的H含量为1.87%,由此可计算得到C70(OH)x中羟基数目为29。

图 1 C70-OH结构分析图 Fig.1 Structure characteristics of C70-OH a. AFM images; b. hydrodynamic size distributions; c. Zeta potentials; d. thermogravimetric analysis; e. elemental analysis
2.2 小鼠的一般行为、存活率、体重和心脏系数的变化

小鼠的行为改变、死亡情况以及体重改变可反映最直观的中毒情况,是毒性实验中最基础的指标。脏器系数是实验动物某脏器的重量与其体重之比值。脏器系数可以间接反映实质性脏器的萎缩或者肿大等变化,从而体现出小鼠的一些生理状况,是毒理实验中研究外源性物质作用靶器官的常用指标之一。

结果如表 1所示,14天实验周期内,各组小鼠全部存活且活动正常, 小鼠体重均有升高,C70-OH组升高的更为明显。与对照组相比,CA4P组心脏系数明显增高(p < 0.05);C70-OH组与对照组相比,未有明显差异。此结果与相关文献报道一致,富勒醇被注射进入体内以后,迅速地输送到器官组织中,在骨组织、肝脏和肾脏分布较多,心脏分布很少,并在一周之内基本排出体外,可避免材料的长期毒性[12]

表 1 体重和心脏系数的变化 Table 1 Change of weight and cardiac index (Mean±SD)
2.3 血生化指标分析

一般情况下,心肌细胞内存在完整的氧化-抗氧化系统,它们的平衡保证了心肌细胞的正常运作。心肌细胞膜受损后,细胞内的多种酶外漏,如谷草转氨酶、肌酸磷酸激酶同工酶和乳酸脱氢酶等,严重影响细胞功能。因此,血清心肌酶谱(AST、CK-MB、LDH、a-HB-DH)是临床上反映心肌损害的主要生化指标。高敏肌钙蛋白T(TNT-Hs)为心肌结构蛋白,是心肌细胞损伤的一个高敏性标志物,可检出某些心肌酶谱不能检出的微小损伤。测试结果如图 2所示,与对照组相比,CA4P组小鼠血清心肌酶(AST、CK-MB、TNT-HS、LDH和a-HB-DH)活性均明显高于正常对照组(p < 0.05);C70-OH组与对照组相比无明显差异。

图 2 C70-OH对血清中AST、CK-MB、TNT-HS、LDH和a-HB-DH的影响 Fig.2 Effect of C70-OH on AST, CK-MB, TNT-HS, LDH, a-HB-DH in serum (*p < 0.05 vs control group)

丙二醛(MDA)作为膜脂质过氧化产物,其含量高低间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度,而超氧化物歧化酶(SOD)活性高低反映机体清除氧自由基的能力。结果如图 3所示,与对照组相比,CA4P组小鼠血清中SOD活性明显下降(p < 0.05),MDA含量明显上升(p < 0.05);C70-OH组与对照组相比无明显差异。

图 3 C70-OH对血清中SOD (a)和MDA (b)的影响 Fig.3 Effects of C70-OH on SOD (a) and MDA (b) in serum (*p < 0.05 vs control group)
2.4 组织病理学检查

病理检查是用以检查机体器官、组织或细胞中的病理改变的形态学方法,通过此方法可以较为直观地观察到组织是否发生病变以及病变位置等。通过对心脏切片的镜下观察,可推测心脏损伤情况。如图 4所示,光镜下观察,正常对照组(图 4a)心外膜完整,未见纤维组织增生;肌层肌纤维无肥大、萎缩、变细,无肌肉纤维断裂、波浪变性,心肌细胞无水样、空泡、脂肪变性,细胞核居中,结构清晰,肌纤维未见坏死及瘢痕组织形成;与正常对照组相比,CA4P组(图 4b)心肌纤维排列紊乱,间隙增大;C70-OH组(图 4c)心肌纤维几乎无空泡样变性,肌纤维完整,排列较整齐,细胞核呈圆形或类圆型,心肌间质未见异常改变。

图 4 C70-OH对心肌组织病理的影响 Fig.4 Effect of C70-OH on cardiac muscle tissue in pathobiology changes (scale bars are 50 μm) a. Control; b. CA4P; c. C70-OH
2.5 心脏超微结构观察

为了进一步探究心脏的超微结构变化,我们对小鼠的心尖部位样本进行了TEM观察。如图 5所示,与正常组(图 5a)相比,CA4P组(图 5b)部分肌丝排列紊乱,出现断裂溶解,线粒体嵴断裂;C70-OH组(图 5c)心肌纤维结构基本正常。

图 5 C70-OH对心肌组织超微结构的影响 Fig.5 Effect of C70-OH on cardiac muscle tissue in ultrastructure changes (Scale bars are 1 μm) a. Control; b. CA4P; c. C70-OH
3 结论

富勒烯由于性能良好,在生物医学应用方面具有巨大潜力。本实验通过小鼠的行为学表现、体重改变、脏器系数变化、血生化指标分析以及组织学观察方面,系统考察了实验室制备的C70-OH对小鼠的毒性损伤情况。本实验给予C70-OH的小鼠血清中AST、CK-MB、LDH、a-HB-DH和TNT-Hs活性没有明显升高,心肌超微结构无明显损伤。本实验结果为C70-OH进一步的体内安全应用提供了依据。

参考文献
[1] Friedman S H, DeCamp D L, Sijbesma R P, Srdanov G, Wud F, Kenyon G L. Inhibition of the HIV-1 protease by fullerene derivatives:model building studies and experimental verification[J]. Journal of the American Chemical Society, 1993, 115(15): 6506–6509. DOI:10.1021/ja00068a005
[2] Lyon D Y, Adams L K, Falkner J C, Alvarezt P J. Antibacterial activity of fullerene water suspensions:effects of preparation method and particle size[J]. Environmental Science & Technology, 2006, 40(14): 4360–4366.
[3] Li J, Guan M R, Wang T S, Zhen M M, Zhao F W, Shu C Y, Wang C R. Gd@C82-(ethylenediamine)8 nanoparticle:a new high-efficiency water-soluble ROS scavenger[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2016, 8(39): 25770–25776.
[4] Zhou Y, Li J, Ma H J, Zhen M M, Guo J, Wang L P, Jiang L, Shu C Y, Wang C R. Biocompatible[60]/[70] fullerenols:potent defense against oxidative injury induced by reduplicative chemotherapy[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2017, 9(41): 35539–35547.
[5] Zhang Y, Shu C Y, Zhen M M, Li J, Yu T, Jiang W, Li X, Deng R J, Zhou Y, Wang C R. A novel bone marrow targeted gadofullerene agent protect against oxidative injury in chemotherapy[J]. Science China Materials, 2017, 60(9): 866–880. DOI:10.1007/s40843-017-9079-6
[6] Guan M R, Ge J C, Wu J Y, Zhang G Q, Chen D Q, Zhang W, Zhang Y, Zou T J, Zhen M M, Wang C R, Chu T W, Hao X J, Shu C Y. Fullerene/photosensitizer nanovesicles as highly efficient and clearable phototheranostics with enhanced tumor accumulation for cancer therapy[J]. Biomaterials, 2016, 103: 75–85. DOI:10.1016/j.biomaterials.2016.06.023
[7] Zhou Y, Deng R J, Zhen M M, Li J, Guan M R, Jia W, Li X, Zhang Y, Yu T, Zou T J, Lu Z G, Guo J, Sun L, Shu C Y, Wang C R. Amino acid functionalized gadofullerene nanoparticles with superior antitumor activity via destruction of tumor vasculature in vivo[J]. Biomaterials, 2017, 133: 107–118. DOI:10.1016/j.biomaterials.2017.04.025
[8] Chen C Y, Xing G M, Wang J X, Zhao Y L, Li B, Tang J, Jia G, Wang T C, Sun J, Xing L, Yuan H, Gao Y X, Meng H, Chen Z, Zhao F, Chai Z F, Fang X H. Multihydroxylated[Gd@C82(OH)22]n nanoparticles:antineoplastic activity of high efficiency and low toxicity[J]. Nano Letters, 2005, 5(10): 2050–2057. DOI:10.1021/nl051624b
[9] Zhen M M, Shu C Y, Li J, Zhang G Q, Wang T S, Luo Y, Zou T J, Deng R J, Fang F, Lei H, Wang C R, Bai C L. A highly efficient and tumor vascular-targeting therapeutic technique with size-expansible gadofullerene nanocrystals[J]. Science China Materials, 2015, 58(10): 799–810. DOI:10.1007/s40843-015-0089-3
[10] Siemann D W, Bibby M C, Dark G G, Dicker A P, Eskens F A, Horsman M R, Marmé D, Lorusso P M. Differentiation and definition of vascular-targeted therapies[J]. Clinical Cancer Research, 2005, 11: 416–420.
[11] Dowlati A, Robertson K, Cooney M, Petros WP, Stratford M, Jesberger J, Rafie N, Overmoyer B, Makkar V, Stambler B, Taylor A, Waas J, Lewin JS, McCrae K R, Remick SC. A phase Ⅰ pharmacokinetic and translational study of the novel vascular targeting agent combretasta-tin a-4 phosphate on a single-dose intravenous schedule in patients with advanced cancer[J]. Cancer Research, 2002, 62(12): 3408–3416.
[12] Wang C, Bai Y, Li H, Liao R, Li J, Zhang H, Zhang X, Zhang S, Yang S T, Chang XL. Surface modification-mediated biodistribution of 13C-fullerene C60 in vivo[J]. Particle and Fibre Toxicology, 2016, 13: 14.