2. 贵州医科大学 分子生物学重点实验室, 贵州 贵阳 550001
2. The key Laboratory of Medical Molecular Biology, Guiyang 550001, Guizhou, P. R. China
神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童高发的颅外实体瘤,其恶性度高、进展快、预后差,易发生肿瘤转移[1],占儿童肿瘤死亡率的15%[2, 3]。目前临床治疗以手术、放疗、化疗为主,但晚期治疗效果较差[4, 5]。
肿瘤的光动力治疗是近年来发展起来的肿瘤治疗新方法。因为光敏剂与肿瘤细胞存在特殊亲和力,所以注入肿瘤患者体内的光敏剂能够被肿瘤选择性摄入,在一定时间内滞留于肿瘤组织或细胞中[6]。当选择特定波长的激光照射肿瘤时,受生物组织中分子氧的诱导,光敏剂可产生强烈的光化学反应,生成单重态氧、自由基、光氧化次级中间产物等活性物质[7]。活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧阴离子(O2·-)、过氧化氢(H2O2)、过氧化自由基(ROO-)、羟基自由基(·OH)等形式[8]。自由基外层的非配对电子,化学性质非常活泼,既是电子供体,又是电子受体。ROS可对细胞膜结构、核酸和蛋白分子产生氧化作用,引起其结构异常和功能障碍。ROS增多会导致机体氧化应激反应,造成细胞损伤,从而破坏蛋白、核酸等重要细胞组分,引起细胞器严重的不可逆损伤和功能障碍,进而达到损伤肿瘤组织的治疗效果[8]。同时,滞留于病变组织中的卟啉在激光照射下会发射荧光,这一现象有别于正常组织,可用于肿瘤细胞的识别和诊断[9]。
目前临床已投入使用的光敏剂仍然存在细胞摄取量低、代谢缓慢、缺乏靶向性、滞后光毒性等问题,因而影响疗效[10]。目前已批准使用和正在进行临床实验的光敏剂绝大多数为卟啉类化合物,它们在400~650 nm区间有多个吸收峰,因此这一波段内的光一般作为激发波长而进行光动力治疗。卟啉结构中含有刚性共轭大环,在可见光区有强吸收,单重态氧的量子产率较高[11],具有良好的生物相容性和明确的代谢途径,所以作为光敏药物被广泛研究和使用[12]。但是卟啉分子间存在π-π堆砌作用和疏水作用,会使其在水溶液中发生聚集,降低单重态氧的量子产率,甚至导致荧光粹灭,影响光动力疗效[13]。研究发现,在卟啉分子上修饰具有较大空间位阻效应的亲水性基团能有效抑制卟啉分子间的荧光猝灭[14]。
本文选择5, 10, 15, 20-4(4-pyridine) porphyrin(H2TPyP)修饰制备化合物5, 10, 15, 20-tetrakis-(N-carboxymethyl-4-pyridinium) porphyrin tetrabromide(TCMePyP),并进行表征,研究该化合物的物理化学性质及对SH-SY5Y肿瘤细胞(一种衍生于人神经母细胞瘤的细胞系)的杀伤作用,以期发现新型的光动力肿瘤诊断及治疗的候选化合物,为进一步研究提供体外实验依据。
1 实验部分 1.1 试剂与仪器H2TPyP购于上海阿拉丁试剂公司;溴乙酸购于日本TCI试剂公司;DMEM购于Hyclone公司;胎牛血清购于四季青公司;青-链霉素购于Gibico公司;0.25%胰酶及DMSO购于碧云天公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)及4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)购于索来宝公司;2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCHF-DA)购于Sigma公司;SH-SY5Y细胞购于ATCC;细胞培养材料购于Nest公司。
核磁共振仪, 美国VRIAN INOVA-400;动态光散射仪, 美国DynaPro Nanostra;恒温培养箱, 美国Thermo公司;超微量微孔分光光度计, 美国Biotek Epoch2;激光共聚焦显微镜, 日本奥林巴斯公司FV1000;Nano ZS纳米粒度Zeta电位仪, 英国Malvern;紫外-可见光分光光度计, 日本岛津仪器公司UV-2600;荧光光谱仪, 美国VRIAN Cary eclipse;525 nm激光治疗仪及660 nm激光治疗仪, 长春亮丽光电有限公司;激光共聚焦显微镜专用培养皿(20 mm), 购于Nest公司。
1.2 TCMePyP的制备及表征参照文献[15]的方法,将H2TPyP(5, 10, 15, 20-4(4-pyridine) porphyrin)(123 mg,0.2 mmol)和溴乙酸(1.19 g,4 mmol)加入50 mL DMF溶解,氮气保护下反应12 h,冷却至室温。减压抽滤后,用三氯甲烷(20 mL)和丙酮(20 mL)分别洗涤两次,再用水/乙腈混合液重结晶,得到红棕色固体产物174 mg,产率为74%。1HNMR(400 MHz,DMSOd6,25 ℃):9.47(d,8H,J=8 Hz),9.16(s,8H),9.98(d,8H,J=8 Hz),4.70(s,8H),-3.12(s,2H)。将H2TPyP与TCMePyP配制成浓度为1×10-5 mol/L的溶液,测定动态光散射(Dynamic laser scattering, DLS)。
将TCMePyP和H2TPyP均溶于DMSO, TCMePyP溶于双蒸水中,配制成浓度为1×10-5 mol/L的溶液,分别测定紫外-可见光谱和荧光光谱(λex=515 nm)。
1.4 细胞培养用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 U/mL)的DMEM培养液于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养SH-SY5Y细胞,隔2 d换液,细胞长至80%汇合时传代。
1.5 SH-SY5Y细胞内ROS的检测将1×105个细胞接种到激光共聚焦专用培养皿内,5%CO2恒温培养箱中培养24 h。弃去培养液,PBS清洗3次。加入1 mL浓度5×10-5 mol/L的TCMePyP-DMEM液,继续培养24 h,PBS洗涤3次。加入1×10-5 mol/L的DCFH-DA无血清培养液,37 ℃避光孵育30 min,用波长525 nm、光照密度为23.88 mW/cm2的激光光斑(直径4 cm)照射,时间分别为0 min、3 min、5 min,然后用激光共聚焦显微镜观察、拍照(DCFH-DA:λex =488 nm,λem=525 nm)。利用Image-Pro plus 6.0图像软件进行分析,按下式计算发射荧光强度:
将1×105个细胞接种到激光共聚焦专用培养皿,5%CO2恒温培养箱中培养24 h。弃去培养液,PBS清洗3次。加入1 mL TCMePyP-DMEM溶液,浓度5×10-5 mol/L,继续培养24 h,PBS清洗3次。用4%多聚甲醇固定15 min,PBS清洗2次,加入100 μL DAPI,PBS清洗,再加入100 μL PBS。用激光共聚焦显微镜测定(DAPI:λex =405 nm,λem=425~490 nm;TCMePyP:λex=549 nm,λem=630~770 nm)。
1.7 TCMePyP对SH-SY5Y细胞的MTT细胞活性检测 1.7.1 TCMePyP细胞毒性测定光动力活性实验TCMePyP溶于DMEM中,配制成1×10-6 mol/L、5×10-6 mol/L、1×10-5 mol/L、1.5×10-5 mol/L、2×10-5 mol/L的溶液,4 ℃避光保存。将2×104个/孔细胞接种于96孔板,5%CO2恒温培养箱中培养24 h,弃去上清液,加TCMePyP-DMEM液培养24 h。PBS清洗3次,加入DMEM液,用波长525 nm、光照密度10.48 mW/cm2的光照2 min,每次单孔垂直照射样本培养孔,余孔锡箔纸覆盖避光。光照后再次培养24 h,弃去上清,每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),避光培养4 h,弃去上清,PBS洗涤后加入DMSO 150 μL,室温振荡5 min,用超微量微孔分光光度计490 nm波长检测吸光度。按下式计算细胞生存率(SR)[16]:
实验分组:浓度1×10-5 mol/L TCMePyP绿光(525 nm)照射组;浓度1×10-5 mol/L TCMePyP红光(660 nm)照射组;浓度1×10-5 mol/L H2TPyP绿光(525 nm)照射组:溶于DMSO后加入DMEM,DMSO浓度为2%;浓度1×10-5 mol/L H2TPyP红光(660 nm)照射组:溶于DMSO后加入DMEM,DMSO浓度为2%;空白对照组:不加药物不予光照。每组3个复孔,药物孵育24 h,PBS洗涤后更换DMEM培养液。光照密度10.48 mW/cm2。分别不同波长激光照射,时间1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min、9 min。每次单孔垂直照射样本培养孔,其余锡箔纸避光。MTT法检测,重复3次。
1.8 倒置显微镜观察TCMePyP-PDT细胞形态改变将2×105个细胞接种于6孔板上,培养24 h。弃去培养液,PBS清洗3次。加入1×10-5 mol/L的TCMePyP-DMEM液2 mL,培养24 h,用波长525 nm、光照强度10.48 mW/cm2的激光分别照射3 min、6min、9min,再培养24 h,在倒置显微镜下观察细胞形态。
2 结果与讨论 2.1 核磁谱图解析卟啉骨架中,由于分子具有共轭效应,吡啶环上的H和吡咯上的H化学位移应位于低场,所以4.70处的H应归属于吡啶N上的亚甲基,低场处的两组二重峰应归属于卟啉骨架吡啶环上的H,即9.47和8.98。通过g-COSY与ROSY NMR二维核磁谱图(图 1)对卟啉骨架吡啶环上H进行归属,如ROSY图所示,4.70的H与9.47的H相关联,而在g-COSY谱图中并无关联,说明吡啶N上的亚甲基的H距离9.47的H在空间上更靠近,所以9.47的H归属于卟啉骨架吡啶环上的Hα,8.98的H归属于卟啉骨架吡啶环上的Hβ。
动态光散射(Dynamic light scattering,DLS),也称光子相关光谱(Photon correlation spectroscopy,PCS),测定随时间变化的光强波动,一般用于检测稀溶液中超分子聚合物的形成[17]。药物可通过滤过和简单扩散等方式通过细胞膜,体内大多数上皮细胞的水性通道直径4~8 nm,毛细血管内皮细胞间的孔隙直径约60~120 nm,水溶性药物分散粒径合适,有利于药物通过细胞膜的水性通道而进行跨膜转运[18]。如图 2所示,25 ℃下,TCMePyP和H2TPyP的溶液表现出单峰分布,水合动力学直径分别分散为~6 nm和~120 nm。这表明通过结构修饰,TCMePyP聚集态水合动力学直径减小。吡啶基上的N质子化,连接上带负电的乙酸基团能增加空间位阻,分子间发生静电排斥作用,有利于化合物在溶剂中分散。据此推测修饰后的化合物以滤过方式更容易通过细胞膜屏障进入细胞。
药物进入体内,需先溶于体液,通过转运抵达细胞膜才能进行脂溶性扩散。药物的脂溶性使药物溶解于细胞膜脂质层,扩散并透过生物膜,进而产生药物效应。因此良好的药效需要药物具有一定的脂溶性与水溶性[18]。H2TPyP溶于DMSO,不溶于水,而修饰后的TCMePyP的水溶性明显改善。如图 3,H2TPyP-DMSO溶液紫外吸收光谱包括两个特征吸收:420 nm左右产生的Soret带与500~670 nm区间弱吸收Q带,Q带包含4个吸收峰。向长波方向移动,吸收谱带的相对强度逐渐减弱。417 nm出现最大吸收0.6142。
TCMePyP上的4个羧基与卟啉环上吡啶基N原子产生共轭效应,使其特征吸收发生红移,强度明显增大。TCMePyP的DMSO溶液最大吸收红移至422 nm,电子吸收明显增强至4.065。而同浓度(1×10-5 mol/L)的H2TPyP的DMSO溶液吸收强度明显小于TCMePyP在这两种溶剂中的吸收。受溶剂极性的影响,TCMePyP水溶液吸收略有红移,在423 nm处达最大。
TCMePyP的DMSO溶液在514 nm处吸收峰明显,其水溶液在520 nm也有明显吸收,二者强度近似。实验结果证实TCMePyP的脂溶性较好,水溶性比H2TPyP明显改善,电子吸收明显增强。
选择λex =515 nm的绿光测定荧光光谱。如图 4,TCMePyP的DMSO溶液和TCMePyP水溶液在646 nm处均发射荧光,相比H2TPyP的DMSO溶液,荧光强度明显增大。这为化合物进入细胞后的进一步定位和单重态氧的测定提供了依据。
如图 5,利用细胞核染料DAPI对细胞核进行定位。用TCMePyP孵育SH-SY5Y细胞24 h后,通过激光共聚焦显微镜观察到药物可以跨越细胞膜屏障进入细胞内。进入细胞的药物分布广泛,细胞质中出现的红色荧光强度更大。TCMePyP产生的红色荧光具有较强穿透力,易于检测,有望用于SH-SY5Y细胞的荧光诊断。
光动力治疗主要是通过光化学作用产生ROS,导致病变组织的坏死和凋亡[19]。肿瘤细胞对ROS比正常细胞更敏感,所以ROS能选择性杀伤肿瘤细胞[20]。DCFH-DA可被细胞内的酯酶水解成二氢二氯荧光素(DCFH), DCFH无荧光,但会被ROS氧化生成二氯荧光素(DCF)而发出绿色荧光,因此检测绿色荧光强度可反映细胞内ROS水平[21]。使用激光共聚焦显微镜成像观察,如图 6(a)、(b)、(c)为TCMePyP药物孵育组。图 6(a)是无光照药物孵育组,产生的绿色荧光强度较低,反映ROS水平较低。随光照时间增加,细胞内绿色荧光强度逐步明显,表明ROS增加。图 6(d)、(e)、(f)为无TCMePyP药物孵育组,光照密度23.88 mW/cm2时,随光照时间增加,绿色荧光无明显增加,表明ROS无明显变化。
通过Image-Pro plus 6.0图像软件对荧光进行定量,实验数据采用SPSS25统计软件分析,用均数±标准差(mean±sd)表示,不同光照时间组间使用T检验分析;以P < 0.05为差异具有统计学意义。结果如图 7,光照密度相同,TCMePyP组光照后,比无TCMePyP孵育组产生的荧光强度显著增强(P < 0.05),TCMePyP光照5 min时,绿色荧光强度增强更为显著(P < 0.01)。这一结果表明药物孵育并通过光照后, 细胞内产生的ROS随光照时间延长而增加,这是对肿瘤细胞产生杀伤的主要原因。
MTT法是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶,使外源性MTT还原生成不溶水的蓝紫色结晶甲瓒而沉积于细胞中,而死亡细胞不能使之还原。细胞中生成的甲臜溶于DMSO,用酶标仪490 nm波长处可以测定甲臜吸光度。一定数目的细胞范围内,MTT结晶量与细胞数成正比,通过OD值可判断活细胞数量[22]。
光动力疗法中,理想的光敏剂暗毒性较低,需要适当波长的激光照射后才能产生细胞杀伤。如图 8所示,TCMePyP在治疗剂量下,如无光照则基本不影响SH-SY5Y细胞的增殖,暗毒性极低。实验光照密度均为10.48 mW/cm2,波长525 nm光照2 min,1×10-5 mol/L和2×10-5 mol/L TCMePyP组SHSY-5Y细胞的生存率分别为52.06%、38.97%。随药物的浓度增大,杀伤效果增强。如图 9所示,1×10-5 mol/L TCMePyP组用525 nm激光照射时间2 min、5 min、9 min,细胞生存率分别为52.06%、23.51%、22.43%。SH-SY5Y细胞随光照剂量增加,细胞生存率下降。TCMePyP对细胞的杀伤比未修饰的H2TPyP更为明显。TCMePyP组用660 nm红光照射9 min,细胞生存率为51.72%。而H2TPyP组在660 nm红光照射下对细胞生存率无明显影响。此结果与测定H2TPyP、TCMePyP光物理性质的结果相符。临床上PDT常见的激光光源有蓝绿光和红光,实验发现绿光、红光照射TCMePyP对SHY-SY5Y细胞均能产生光动力效应。
通过倒置荧光显微镜观察细胞形态(图 10),空白对照组细胞呈多角形或梭形贴壁生长,排列紧密,生长状态良好。TCMePyP药物组光照3 min后,贴壁细胞数目明显减少,细胞分布较为稀疏,梭型细胞少许,部分细胞变圆,还有少量细胞出现细胞膜崩解、破裂。光照6 min,崩解的细胞增多,少量细胞保持变圆形态,出现胞质空泡化,未见到梭型细胞。光照9 min,大量细胞崩解,细胞形态模糊,细胞体积缩小,呈现坏死样改变。
本文合成了化合物TCMePyP并进行了表征,研究了其理化性质、光敏化能力、对SH-SY5Y细胞的光动力杀伤作用和药物的细胞内定位,检测了光动力过程中细胞内ROS的变化。实验发现TCMePyP化合物具备成为优秀光敏剂的条件:脂溶性好, 水溶性比H2TPyP显著改善,可见光区的电子吸收明显,激发可产生较强荧光。此外,该化合物暗毒性较低、光毒性显著, 在细胞中定位明确,进行光动力处理后产生的ROS对SH-SY5Y细胞杀伤明显。以上结果为继续开发有效的光动力抗肿瘤或诊断候选药物提供了参考。
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