2. 浙江大学 药学院, 浙江 杭州 310058
2. College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, P. R. China
随着生命科学研究的深入,对高通量、大视野、大面积样品分析的需求越来越强烈。玻片扫描系统是利用全自动显微镜扫描系统,结合虚拟切片软件,将传统玻璃切片进行扫描和无缝拼接,最终生成一整张全视野的数字切片[1],该文件包含了组织切片上所有的组织信息,使传统物质化的载玻片变成新一代数字化病理切片,这是对病理诊断技术划时代的变革。配合自动进样,可对大量切片进行明场和荧光图像的分析。优势:数字切片系统对切片上组织全景扫描,信息全;减少拍照时视野局限性;扫描速度快,图片清晰;科研人员可脱离显微镜,在电脑上即可实现组织切片任意部位任意倍数(1~400倍)的观察和图片截取;一次成像永久保存,减少玻片物理损坏或丢失,荧光猝灭等造成切片的信息缺失。
蔡司的Axio Scan.Z1是研究级全自动数字玻片扫描系统,是一款集切片自动进样、装载、扫描、图像处理、图像保存为一体的自动化仪器。样品夹采用“托盘”设计,Axio Scan.Z1能够做到扫描载玻片上的全部标本区域,包括玻片的边缘部分。具有操作自动化、运行智能化等特点,质量稳定、使用寿命长、操作简便,并可对图片进行长期保存。仅需几分钟时间,自动校正切片扫描仪系统便可获得高质量的数字虚拟玻片图像。具有全自动明场、荧光及偏振光玻片扫描功能,快速又可靠,一次可扫描多达100张常规玻片。下面介绍该系统的配置参数及成像特点。
1 配置参数 1.1 自动玻片进样系统单次装载数量不小于100片,可连续追加自动扫描。托盘式样品夹(可适用于3种玻片规格:26 mm×76 mm,52 mm×76 mm,或102 mm ×76 mm)。适应各种不同标本,包括人脑、猴脑等超大尺寸玻片。
1.2 系统设计主机采用箱体式设计,结构紧凑,箱式结构对玻片起较好的保护作用,系统校准简单、易操作。
1.3 物镜Plan-Apochromat复消色差物镜10×,数值孔径NA= 0.45,分辨率0.44 μm/pixel;20×,数值孔径NA=0.8,分辨率0.22 μm/pixel;40×,数值孔径NA=0.95, 分辨率0.11 μm/pixel,Fluar(2.5×, 5×)。
1.4 照明透射光光源:LED (波长范围400~700 nm,最高亮度460 nm);荧光光源:365、385、420、445、470、505、530、590、615、625 nm等。利用斜照明查找焦平面的位置,环形光阑照明方式,显著降低光漂白,确保对样本提供最大限度的保护。滤片转盘:10位带ACR(自动组件识别功能)的滤片或6位高速激发滤片转盘;6位高速分光滤片转盘;6位高速发射滤片转盘。
1.5 双相机明场扫描用高色彩还原3芯片CCD相机(型号:Hitachi HV F202SCL),1600×1200像素有更好的色彩还原。荧光扫描用高灵敏SCOMS单色照相机(型号:Hamamatsu Flash 4.0),可提供高速度(4MP)高灵敏度高动态范围图像扫描(16 bit,100 fps)。
1.6 软件ZEN slidescan软件模块专用于拍摄虚拟切片,同时ZEN软件图像分析工具为研究人员提供精准数据。ZEN Lite软件包括编辑和浏览虚拟切片图像的功能,可使用总览图导航到感兴趣的区域,追踪任何看过的地方。使用圆形、矩形、线条、箭头、文本、轮廓图等对图像进行标注。可处理CZI、TIFF、JPEG、PNG和GIF等格式的图片,实现更大兼容性及共享虚拟显微图像。从视图菜单中或图库中选择2D模式和直方图模式,还可以对单个或批量图像进行锐化、模糊、几何函数和颜色调整处理。
2 成像特点 2.1 明场扫描以20×物镜,标准26 mm × 76 mm玻片为例,在薄片样品尺寸为15 mm×15 mm,分辨率0.22 μm/pixel条件下,扫描得到薄片的概览图和明场图像的时间约为4 min。
2.2 荧光成像对于多通道荧光成像来说,速度和光照柔和是最重要的。使用Axio Scan.Z1的标准荧光滤色块,可获取最多达9个荧光通道的样本图像。或可使用3个同步高速运转的滤片转轮用于激发、分光和发射。荧光通道之间切换为50 ms,无需使用三通或四通发射滤色片。具有独特的Ring aperture contrast成像模式,在荧光扫描时可以快速进行聚焦地形图设置。
2.3 LED光源Colibri.2 LED光源光照柔和,将样本的损伤降至更低。
2.4 层扫及景深扩展具有z-stack及景深扩展功能,且无层数限制。
2.5 转换速度快可在毫秒内转换激发的波长,当使用三通或四通滤片时,光路中不会有任何机械部件的移动。
2.6 自动识别和校准自动识别扫描区域并校准,从几何校准到色差校准,数字虚拟玻片图像可以在任何时间准确地重现。
2.7 批量扫描可批量设置扫描条件(profile),真正为高通量扫描设计。
3 蔡司Axio Scan.Z1全自动切片扫描系统的应用目前,蔡司Axio Scan.Z1全自动切片扫描系统应用广泛,如阿尔茨海默病的发病机制、神经科学、植物生物学、发育生物学、免疫学、毒理学,以及荧光原位杂交、偏振扫描等应用[2-12]。Dyment等[13, 14]将其应用于矿化组织的高通量,多图像冷冻组织学研究,还可用于高通量研究及预实验研究,将不同的显微技术进行优化,节省大量时间和资源[15, 16]。在实际使用中,我们用蔡司Axio Scan.Z1全自动切片扫描系统,拍摄到荧光脑片、荧光肠切片、明场肾脏组织切片、明场尼氏染色脑切片的完整成像图片及细节放大图片,如图 1~5所示。
样本类型:荧光脑片。通过脑立体定位注射技术,在小鼠下丘脑腹内侧核区和前脑内侧束区同时注射带绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的AAV腺相关蛋白。灌流取脑,冰冻切30 μm脑片,复染DAPI标记细胞核后,贴片观察。拍摄物镜:Plan-Apochromat 10×物镜(NA=0.45);拍摄参数:FL Red-30 ms、FL Green-50 ms、FL Blue-5 ms。利用Axio Scan.Z1全自动切片扫描系统及多色成像功能获得整张脑片的大视野拼图,结合病毒示踪技术,感染不同类型的神经元,实现某特定脑区的功能性研究。具体效果见图 1。
3.2 荧光肠切片样本类型:荧光肠切片。拍摄物镜:Plan-Apochromat 20×物镜(NA=0.8);拍摄参数:FL Red-10 ms、FL Green-10ms、FL Blue-5 ms。利用全自动切片扫描系统及多色成像功能,获得小肠切片的大视野拼图,并就感兴趣的区域进行放大,具体效果见图 2。
3.3 荧光脑切片样本类型:荧光脑切片。拍摄物镜:Plan-Apochromat 20×物镜(NA=0.8);拍摄参数:FL Red-1 ms、FL Green-5 ms、FL Blue-5 ms。利用全自动切片扫描系统获得荧光脑切片的大视野拼图,并就感兴趣的区域海马区放大拍摄,具体效果见图 3。
3.4 明场肾脏组织切片样本类型:明场肾脏组织切片。拍摄物镜:Plan-Apochromat 20×物镜(NA=0.8);拍摄参数:TL曝光时间200 μs。利用全自动切片扫描系统明场拍摄,获得肾脏组织切片的大视野拼图及感兴趣区域细节图,具体效果见图 4。
3.5 明场尼氏染色脑切片样本类型:明场尼氏染色脑切片。拍摄物镜:Plan-Apochromat 20×物镜(NA=0.8);拍摄参数:TL曝光时间200 μs;利用全自动切片扫描系统明场拍摄,获得尼氏染色脑切片的大视野拼图及感兴趣区域细节图,具体效果见图 5。
4 仪器使用过程中的常见问题、原因分析及解决方案 4.1 问题一明场下,无法准确找到焦距。54张明场片子,总共285张脑片,有83张脑片无法找到正确的焦平面,找焦准确度只有71%。原因可能是:经测试后发现在玻璃片上有一层用于固定脑片的明胶(图 6),明胶层在粗调焦时被检测到,并被系统认为是信号进行扫描。而明胶层和脑片信号的距离约为100 μm。解决方案:因无法避免明胶层和不同厚度的玻片影响,需要针对每张片子调整粗调范围。
20×(NA=0.8)物镜成像效果没有10×(NA=0.45)物镜效果好(图 7)。原因可能是10×物镜的焦深比20×的更大。解决方案:使用10×的物镜。
40×/0.95物镜拍摄效果不佳(图 8)。原因可能是40×物镜对于封片剂的折射率和玻片的厚度较为敏感。解决方案:尝试使用20×/0.8物镜。
全自动切片扫描技术优势巨大,应用范围广,已逐步成为形态学研究和病理学的一种变革性辅助手段。蔡司Axio Scan.Z1全自动切片扫描系统使用频率较高,能实现全自动化扫描。对于样本数量较大的用户,极大地节省了时间成本和人力。仪器的机箱式设计能保证整个系统的稳定性,避免因外界环境引起的扫描问题。拍摄同批次的玻片,因均设置相同的“Profile”,能保证所有样本的参数一致性。但是,使用过程中存在一个较大的问题:对于制片较脏或不佳的样本,找不到正确的焦平面。这是因为该仪器是全自动化的扫描方式,不存在手动对焦的策略,不能人为地调整焦平面。此外,由于玻片的厚度及样本均存在差异,使用相同的参数设置不利于系统准确找到焦平面。根据拍摄经验,针对一些不容易找到焦平面的样本,我们建议通过控制粗调焦的范围,采取增加聚焦点个数,进行调整拍摄。
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