胰腺癌是临床常见消化系统恶性肿瘤,其早期症状缺乏特异性,起病隐匿,加之胰腺癌病灶位置较深,易被腹腔组织器官遮盖,导致胰腺癌诊断延误,影响预后[1]。因此,寻找一种合理有效的胰腺癌诊断方法,完善早期检测方案是临床研究的重点环节之一。目前, CT是临床诊断腹腔疾病主要影像学手段,随着多层螺旋CT(multilayer spiral CT,MSCT)灌注成像技术的发展,可为分析组织器官血流动力学提供影像参数,便于从血流动力学方面定性判断正常组织或恶变组织,为胰腺癌良恶性诊断提供依据[2]。临床研究已证实,肿瘤属血管依赖性疾病,其中微血管密度(microvascular density,MVD)是反映肿瘤血管生成效应的主要参数,被作为判定肿瘤血管生成的“金标准”,且与肿瘤侵袭性和预后关系密切[3, 4]。基于此,本研究对MSCT灌注成像参数对胰腺癌鉴别诊断效果及与肿瘤恶性生物学行为、微血管密度的关系进行探讨,旨在为临床早期诊断提供参考。
1 资料与方法 1.1 一般资料选取2016年7月~2019年8月我院胰腺癌患者68例为胰腺癌组,同期行手术治疗的68例急性胰腺炎患者为胰腺炎组。均经病理诊断确诊胰腺癌/胰腺炎;首次发病;既往无腹部手术史;知情本研究并签署同意书。排除标准:无法耐受手术者;恶液体征者;合并其他疾病致全身感染者;伴凝血功能障碍者。2组年龄、性别、体质量指数、症状等基础资料见表 1,具有可比性(P>0.05)。
飞利浦Brilliance32多层螺旋CT机首先平扫,再行CT灌注扫描,最后完成胰腺多期扫描。检查当天禁食,检查前饮温水800 mL充盈胃、小肠。
扫描方式:(1)平扫,范围膈顶-肝下缘,参数110 kV,200 mA, 螺距1.0,层厚5 mm。(2) CT灌注扫描,检查前训练呼吸,告知造影剂可能引起的发热反应,以5 mL/s注入50 mL造影剂,延迟8 s,120 kV,60 mA,5 mm,间隔1 s,周期1.0 s,采集数据时间45 s,扫描22次,8层/次,共生成重建图像176帧。(3)多期增强扫描,灌注扫描完成后追加70 mL造影剂,速度2.5 mL/s,扫描动脉期25 s,胰腺期45 s,门脉期70 s,层厚5 mm,重建层厚0.625,多角度观察病变。
1.2.2 分析平扫和多期图像分析:全部图像均于工作站(ADW4.2)处理,分析轴状位、冠状位、矢状位、斜位MPR图像或VR重建图像。
CT灌注图像分析:采取Perfusion 2软件包分析数据,腹主动脉作为流入血管,从单层连续动态图内病灶组织、胰腺组织及腹主动脉感兴趣区获取血流血容量(BV)、平均通过时间(MTT)、血流量(BF)、表面通透性(PS)彩色灌注图。
数据资料处理:由2位或以上高级职称影像科医师分别分析图像,判定病灶性质、强化程度,结论不一致时经讨论达成一致结果。
1.2.3 微血管密度(MVD)值检查获取标本时标记方位,结合CT扫描位置尽量在CT灌注靶平面感兴趣位置取材,甲醛(40 g/L)固定,脱水,透明处理,石蜡包埋制蜡块备用;采取链霉菌抗生物蛋白-过氧化酶免疫组化(SP)法试剂盒、鼠抗人CD34检查MVD。MVD计数:任何被CD34抗体染色为棕黄孤立的内皮细胞簇团或内皮细胞,与周围恶性细胞、微血管或其他芥蒂组织分开者属一个微血管,若结构未相连,其分支同样为一个微血管,排除血管内径可容纳8个及以上红细胞及存在肌肉细胞的血管;首先×40低倍镜扫视切片,确认高密度区(3个),切换×200高倍镜,计数取平均值。
1.2.4 基因检测以实时荧光定量PCR(polymerase chain reaction)技术测目标基因表达量,包括肿瘤侵袭基因(HOXB7、Twist)、增殖基因(FOXC1、Bmi-1)。
具体操作:裂解标本细胞,实施两相分离,取无色水相上层,移至离心管内,加等体积异丙醇沉淀RNA,清洗RNA凝胶块,室温干燥,加水40 μL制成RNA溶液,冷冻备用;紫外线吸收法测RNA纯度;采取反转录试剂盒制成样品cDNA;待测样品试管实施PCR检测,设置良性组织内目标基因表达量作为标准值100,计算标本组织内目标基因相对表达量。
1.3 观察指标(1) 对比2组胰腺组织MSCT灌注成像参数(BV、BF、PS、MTT); (2) ROC曲线分析MSCT灌注成像参数(BV、BF、PS、MTT)诊断胰腺癌的价值; (3)对比不同临床分期胰腺癌患者胰腺组织MSCT灌注成像参数(BV、BF、PS、MTT); (4)对比不同临床分期胰腺癌患者组织中肿瘤侵袭基因(HOXB7、Twist)、增殖基因(FOXC1、Bmi-1)表达量; (5)对比不同临床分期胰腺癌患者组织中MVD值; (6)分析MSCT灌注成像参数(BV、BF、PS、MTT)与胰腺癌肿瘤侵袭、增殖基因、MVD值的相关性。
1.4 统计学处理采用SPSS 22.0统计分析软件,计数资料以率表示,2组间比较采用χ2检验;相关性以Pearson相关性系数分析;符合正态分布的计量资料以(x±s)表示,2组间比较采用t检验;ROC曲线评估MSCT灌注成像参数对胰腺癌的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 2组胰腺组织MSCT灌注成像参数胰腺癌组BV、BF及PS水平低于胰腺炎组,MTT高于胰腺炎组(P<0.05)。见表 2。
BV、MTT、BF及PS联合诊断胰腺癌的AUC为0.881,均高于BV、MTT、BF及PS单一指标诊断的0.796、0.801、0.730、0.766,联合诊断敏感度为83.82%,特异度为85.29%。见表 3、图 1、图 2。
胰腺癌组临床分期为Ⅲ~Ⅳ期的患者,其BV、BF及PS水平低于Ⅰ~Ⅱ期患者,MTT高于Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05)。见表 4。
胰腺癌组临床分期为Ⅲ~Ⅳ期患者组织标本中FOXC1、Bmi-1、HOXB7、Twist mRNA表达量高于Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05)。见表 5。
胰腺癌组临床分期为Ⅲ~Ⅳ期患者组织标本中MVD值平均为(58.72±10.83)条,Ⅰ~Ⅱ期患者为(43.67±5.38)条,组间比较,Ⅲ~Ⅳ期患者高于Ⅰ~Ⅱ期患者(t=7.038, P<0.001)。
2.6 MSCT灌注成像参数与患者肿瘤侵袭、增殖基因、MVD值的相关性胰腺癌患者MSCT灌注成像参数的BV、BF、PS与FOXC1、Bmi-1、HOXB7、Twist mRNA表达量、MVD值呈明显负相关,MSCT灌注成像参数的MTT与FOXC1、Bmi-1、HOXB7、Twist mRNA表达量、MVD值呈明显正相关(P<0.05)。见表 6。
胰腺血流丰富,其病变会直接影响胰腺实质血流灌注[5]。MSCT灌注成像技术能反映器官实质水平血供状态,胰腺癌为低血供病灶,此特征决定实质功能学变化早于形态学变化[6]。因此,理论上检测其异常情况对早期诊断胰腺癌具有重要作用。
西方学者最早应用胰腺MSCT灌注成像诊断胰腺疾病,发现胰腺正常患者胰腺灌注量为1.25~1.66 mL/(min·mL)[7]。国内学者测得胰腺灌注值为(90.6±29.25)mL/(100 mL·min)[8]。本研究显示,胰腺癌患者BV值为(7.96±2.85)mL/kg,与上述研究存在较大偏差,可能与应用数学模型及灌注软件不同有关。本研究还显示,与急性胰腺炎患者相比,胰腺癌患者BV、BF及PS水平显著降低(P<0.05),与胰腺癌低血供这一生理特点相符,且与学者雷江侠[9]研究结果一致。本研究测得胰腺癌组MTT高于胰腺炎组(P<0.05),可能与胰腺癌病灶血管壁不完整有关。基于上述研究,MSCT灌注成像参数BV、BF、PS、MTT可为胰腺癌早期鉴别诊断提供新方向。但有学者指出,胰腺体积小,相对而言胰腺癌病灶体积更小,MSCT检测对层厚选择要求高,层厚太大易受容积效应影响,层厚太薄会增加图像噪声[10]。临床胰腺扫描常采取5~10 mm层厚,赵常红等[11]所采取灌注扫描层厚为10 mm,本研究所用灌注扫描层厚为5 mm,结果显示,本研究测得结果标准差绝对值为同类研究最低,说明本研究准确性更高,进一步ROC曲线分析显示,BV、MTT、BF及PS联合诊断胰腺癌的AUC值最大0.881,敏感度为83.82%,特异度为85.29%,具有较高诊断价值。
恶性肿瘤生长依赖于新生血管形成,MVD值高低可间接反映病灶恶性程度[12]。但有报道显示,大肠癌患者MVD值与淋巴结转移、肿瘤分期、预后无相关性[13]。黄婷等[14]的研究表明,胰腺炎、胰腺癌患者间MVD值有差异,即胰腺癌组织微血管分布更密集,本研究结果与之一致。此外,MSCT灌注成像参数值与恶性病灶病理改变有关,揭示参数值改变属新生血管显微解剖学变化的副本[15, 16],MSCT灌注成像参数可用于评估病灶血管新生状态。有研究显示,恶性病灶新生血管形成不仅会刺激病灶生长、转移,还可造成灌注量、血容量、毛细血管通透性改变[17]。本研究胰腺癌患者FOXC1、Bmi-1、HOXB7、Twist mRNA表达量、MVD值与MSCT灌注成像参数BV、BF、PS呈负相关,与MTT呈正相关(P<0.05)。正常胰腺组织细胞存在增殖/凋亡平衡状态,在癌变发生早期即存在细胞凋亡抑制、增殖活性增强现象,二者协同作用加重病情进展[18],随胰腺癌病情加重,病灶组织内FOXC1、Bmi-1、HOXB7、Twist基因表达呈升高趋势(P<0.05)。FOXC1、Bmi-1、HOXB7、Twist在不同研究中均被证实与胰腺癌细胞增殖活性密切相关,其中FOXC1基因过表达能直接抑制胰腺癌细胞凋亡,并促进恶性细胞G0/G1期进展;HOXB7基因过表达可直接增加恶性细胞侵袭活性[19]。上述结果表明,肿瘤侵袭、增殖基因过表达及MVD值升高共同促进胰腺癌分期进展,此与恶性肿瘤基因学演进特征吻合,临床可通过MSCT灌注成像参数值变化评估胰腺癌患者病情特征及预后转归。
综上可知,MSCT灌注成像参数对胰腺癌鉴别诊断有一定临床价值,BV、BF、PS、MTT参数值与肿瘤侵袭基因、增殖基因、MVD值关系密切,可为临床病情及预后评估提供理论依据。
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